HSU S. M.; RAINE L.; FANGER H. Use of avidinbiotinperoxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a
comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. J. Hist. Soc., v. 29, p. 577580, 1981.
DABBS, D. Diagnostic Immunohistochemistry. Churchill Livingstone; 2 ed., 2006, 848 p.
DENNIS M. M.; MCSPORRAN K. D.; BACON N. J. et al. Prognostic factors for cutaneous and subcutaneous soft tissue sarcomas
in dogs. Vet. Pathol., v. 48, p. 7384, 2011.
BERGIN, I. L.; SMEDLEY, R. C.; ESPLIN, D. G. et al. Prognostic evaluation of Ki67 threshold value in canine oral melanoma.
Vet. Pathol., v. 48, p. 4153, 2011.
LAPRIE, C.; ABADIE, J.; AMARDEILH, M. F. et al. MIB1 immunoreactivity correlates with biologic behaviour in canine
cutaneous melanoma. Vet. Dermatol. V. 12, p. 13947, 2011.
KIUPEL, M.; SMEDLEY, R. C.; PFENT, C. et al. Diagnostic algorithm to differentiate lymphoma from inflammation in feline
small intestinal biopsy samples. Vet. Pathol., v. 48, p. 212222, 2011.
WEBSTER, J. D.; YUZBASIYANGURKAN, V.; MILLER, R.A. et al. Cellular proliferation in canine cutaneous mast cell
tumors: associations with cKIT and its role in prognostication. Vet. Pathol., v. 44, p. 298308, 2007.
THOMPSON, J. J.; YAGER, J. A.; BEST, S. J. et al. Canine subcutaneous mast cell tumors: cellular proliferation and KIT
expression as prognostic indices. Vet. Pathol., v. 48, p. 169181, 2011.
KATO, Y.; MURAKAMI, M.; HOSHINO, Y. et al. The class A macrophage scavenger receptor CD204 is a useful
immunohistochemical marker of canine histiocytic sarcoma. J. Comp. Pathol., v. 148, p. 188196, 2013.
GAMA A.; PAREDES J.; GÄRTNER F. et al. Expression of Ecadherin, Pcadherin and betacatenin in canine malignant mammary
tumours in relation to clinicopathological parameters, proliferation and survival. Vet. J., v. 177, p. 4553, 2008.
PEÑA L. L.; NIETO A. I.; PÉREZALENZA D. et al. Immunohistochemical detection of Ki67 and PCNA in canine mammary
tumors: relationship to clinical and pathologic variables. J. Vet. Diagn. Invest., v. 10, p. 237246, 1998.
Bibliografia
AFFOLTER, V. K.; MOORE, P. F. Feline progressive histiocytosis. Vet. Pathol., v. 43, p. 646655, 2006.
AVALLONE, G.; HELMBOLD, P.; CANIATTI, M. et al. The spectrum of canine cutaneous perivascular wall tumors: morphologic,
phenotypic and clinical characterization. Vet. Pathol. v. 44, p. 607620, 2007.
BAINES, S. J.; MCINNES, E. F.; McCONNELL, I. Ecadherin expression in canine cutaneous histiocytomas. Vet. Rec., v. 162, p. 509513,
2008.
BLACKWOOD, L.; MURPHY, S.; BURACCO, P. et al. European consensus document on mast cell tumours in dogs and cats. Vet. Comp.
Oncol., v. 10, p. e1e29, 2012.
BUSCH, M. D.; REILLY, C. M.; LUFF, J. A. et al. Feline pulmonary Langerhans cell histiocytosis with multiorgan involvement. Vet.
Pathol. v. 45, p. 81624, 2008.
CASERTO, B. G. A comparative review of canine and human rhabdomyosarcoma with emphasis on classification and pathogenesis. Vet.
Pathol., v. 50, p. 806826, 2013.
CASSALI G. D.; LAVALLE G. E.; NARDI A. B. et al. Consensus for the diagnosis, prognosis and treatment of canine mammary tumours.
BJVP., v. 4, p. 153180, 2011.
CHANDLER, H. L; NEWKIRK, K. M.; KUSEWITT, D. F. et al. Immunohistochemical analysis of ocular hemangiomas and
hemangiosarcomas in dogs. Vet. Ophthalmol., v. 12, p. 8390, 2009.
CHIJIWA, K.; UCHIDA K.; TATEYAMA S. et al. Immunohistochemical evaluation of canine peripheral nerve sheath tumors and other
soft tissue sarcomas. Vet. Pathol., v. 41, p. 30718, 2004.
COBBOLD, S. P.; METCALF, S. Monoclonal antibodies that define canine homologies of human CD antigens: summary of the first
international canine leukocyte antigen workshop (CLAW). Tissue Antigens., v. 43, p. 13754, 1994.
CRUZ CARDONA, J. A.; WAMSLEY, H. L.; FARINA, L. L. Metastatic pancreatic polypeptidesecreting islet cell tumor in a dog. Vet.
Clin. Pathol., v. 39, p. 371376, 2010.
ETTINGER, S. N.; SCASE T. J.; OBERTHALER K. T. et al. Association of argyrophilic nucleolar organizing regions, Ki67, and
proliferating cell nuclear antigen scores with histologic grade and survival in dogs with soft tissue sarcomas: 60 cases (19962002). J.
Am. Vet. Med. Assoc., v. 228, p. 10531062, 2006.
FABRIEK, B. O.; POLFLIET, M. M.; VLOET, R. P. et al. The macrophage CD163 surface glycoprotein is an erythroblast adhesion
receptor. Blood., v. 109, p. 52235229, 2007.
FERNANDEZ, N. J.; WEST K. H.; JACKSON M. L. et al. Immunohistochemical and histochemical stains for differentiating canine
cutaneous round cell tumors. Vet. Pathol., v. 42, p. 437445, 2005.
FINOTELLO, R.; MARCHETTI, V.; NESI, G. et al. Pancreatic islet cell tumor secreting insulinalike growth factor typeII in a dog. J.
Vet. Intern. Med., v. 23, p. 12891292, 2009.
FONTAINE, J.; HEIMANN M.; DAY M. J. Canine cutaneous epitheliotropic Tcell lymphoma: a review of 30 cases. Vet. Dermatol., v. 21,
p. 26775, 2010.
GERALDES, M.; GÄRTNER F.; SCHIMITT F. et al. Immunohistochemical study of hormonal receptors and cell proliferation in normal
canine mammary glands and spontaneous mammary tumours. Vet. Rec., v. 146, p. 403406, 2001.
GOLDSCHMIDT, M.; PENA, L.; RASOTTO, R. et al. Classification and grading of canine mammary tumors. Vet. Pathol., v. 48, p. 117
31, 2011.
JENNINGS, R. N.; MILLER, M. A.; RAMOSVARA, J. A. Comparison of CD34, CD31, and factor VIIIrelated antigen
immunohistochemical expression in feline vascular neoplasms and CD34 expression in feline nonvascular neoplasms. Vet. Pathol., v.
49, p. 5327, 2012.
KATO, K.; UCHIDA, K.; NIBE, K. et al. Immunohistochemical studies on cytokeratin 8 and 18 expressions in canine cutaneous adnexus
and their tumors. J. Vet. Med. Sci., v. 69, p. 23339, 2007.
KIM, D. Y.; CHO D. Y.; KIM D. Y. et al. Malignant peripheral nerve sheath tumor with divergent mesenchymal differentiations in a dog.
J. Vet. Diagn. Invest., v. 15, p. 1748, 2003.
KIUPEL, M. Diagnostic algorithm to differentiate lymphoma from inflammation in feline small intestinal biopsy samples. Vet. Pathol., v.
48, p. 21222, 2011.
KIUPEL, M.; CAPEN, C.; MILLER, M. et al. Histological classification of tumors of the endocrine system of domestic animals. World
Health Organization Tumor Fascicles. 122 p.
KIUPEL, M.; TESKE, E.; BOSTOCK, D. Prognostic factors for treated canine malignant lymphoma. Vet. Pathol.,v. 36, p. 292300, 1999.
KLOPFLEISCH, R. Canine cutaneous peripheral nerve sheath tumours versus fibrosarcomas can be differentiated by neuroectodermal
marker genes in their transcriptome. J. Comp. Pathol., v. 148, p. 197205, 2013.
LANE, L. V.; ALLISON, R. W.; RIZZI, T. R. et al. Canine intravascular lymphoma with overt leukemia. Vet. Clin. Pathol., v. 41, p. 8491,
2012.
LIU, S. M.; MIKAELIAN, I. Cutaneous smooth muscle tumors in the dog and cat. Vet. Pathol., v. 40, p. 68592, 2003.
MALLETT, C. L.; NORTHRUP, N. C.; SABA, C. F. et al. Immunohistochemical characterization of feline mast cell tumors. Vet.
Pathol.; v. 50, p. 1069, 2013.
MATOS, A. J. F.; LOPES C.; CARVALHEIRA J. et al. Ecadherin expression in canine malignant mammary tumours: relationship to
other clinicopathological variables. J. Comp. Pathol., v. 134, p. 18289, 2006.
McGAVIN, M. D. Factors affecting visibility of a target tissue in histologic sections. Vet. Pathol. v. 51, p. 927, 2014.
MOORE, P. F. A review of histiocytic diseases of dogs and cats. Vet. Pathol., v. 51, p. 16784, 2014.
MOORE, P. F.; AFFOLTER V. K.; KELLER S. M. et al. Canine inflamed nonepitheliotropic cutaneous Tcell lymphoma: a diagnostic
conundrum. Vet. Dermatol., v. 24, p. 20411, 2013.
MOORE, P. F.; AFFOLTER, V. K.; VERNAU, W. Canine hemophagocytichistiocytic sarcoma: a proliferative disorder of CD11 d+
macrophages. Vet. Pathol., v. 43, p. 63245, 2006.
NAGATA, M.; HIRATA, M.; ISHIDA, T. et al. Progressive Langerhans’ cell histiocytosis in a puppy. Vet. Dermatol., v. 11, p. 24146, 2000.
NIETO, A. Immunohistologic detection of estrogen receptor alpha in canine mammary tumors: clinical and pathologic associations and
prognostic significance. Vet. Pathol., v. 37, p. 23947, 2000.
PARK, C. H. A case report of traumatic neuroma of the cervical spinal cord in a dog. J. Vet. Med. Sci., v. 74, p. 78790, 2012.
PEÑA, L.; GAMA, A.; GOLDSCHMIDT, M. H. et al. Canine mammary tumors: a review and consensus of standard guidelines on
epithelial and myoepithelial phenotype markers, HER2, and hormone receptor assessment using immunohistochemistry. Vet.
Pathol.v.51, p. 12745, 2014.
PIRES, I.; QUEIROGA, F. L.; ALVES, A. et al. Decrease of Ecadherin expression in canine cutaneous histiocytoma appears to be related
to its spontaneous regression. Anticancer Res., v. 29, p. 271317, 2009.
POHLMAN, L. M.; HIGGINBOTHAM, M. L.; WELLES, E. G. et al. Immunophenotypic and histologic classification of 50 cases of
feline gastrintestinal lymphoma. Vet. Pathol., v. 46, p. 259268, 2009.
PONCE, F. et al. A morphological study of 608 cases of canine malignant lymphoma in France with a focus on comparative similarities
between canine and human lymphoma morphology. Vet. Pathol., v. 47, p. 41433, 2010.
RAMOSVARA, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet. Pathol., v. 42, p. 40526, 2005.
RAMOSVARA, J. A.; KIUPEL, M.; BASZLER, T. et al. Suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary
diagnostic laboratories. J. Vet. Diagn. Invest., v. 20, p. 393413, 2008.
RAMOSVARA, J. A.; MILLER, M. A. Immunohistochemical expression of Ecadherin does not distinguish canine cutaneous
histiocytoma from other canine round cell tumors. Vet. Pathol., v. 48, p. 75863, 2011.
RAMOSVARA, J. A.; MILLER, M. A. When tissue antigens and antibodies get al.ong: revisiting the technical aspects of
immunohistochemistry – the red, brown, and blue technique. Vet. Pathol., v. 51, p. 4287, 2014.
RAMOSVARA, J. A.; MILLER, M. A.; VALLI, V. E. Immunohistochemical detection of multiple myeloma 1/interferona regulatory
factor 4 (MUM1/IRF4) in canine plasmacytoma: comparison with CD79 and CD20. Vet. Pathol., v. 44, p. 87584, 2007.
RAMOSVARA, J. A.; WEBSTER, J. D.; DUSOLD, D. et al. Immunohistochemical evaluation of the effects of paraffin section storage
on biomarker stability. Vet. Pathol. v. 51, p. 1029, 2014.
REIMER, S. B.; PELOSI, A.; FRANK, J. D. et al. Multiple endocrine neoplasia type I in a cat. J. Am. Vet. Med. Assoc., v. 227, p. 1014,
2005.
REIS, A. L. et al. Immunohistochemical study of the expression of Ecadherin in canine mammary tumours. Vet. Rec., v. 152, p. 62124,
2003.
RESTUCCI, B. et al. Expression of betacatenin, Ecadherin and APC in canine mammary tumors. Anticancer Res., v. 27, p. 30839, 2007.
SABATTINI, S.; BETTINI, G. An immunohistochemical analysis of canine haemangioma and haemangiosarcoma. J. Comp. Pathol. v.
140, p. 15868, 2009.
SABATTINI, S.; BETTINI, G. Prognostic value of histologic and immunohistochemical features in feline cutaneous mast cell tumors.
Vet. Pathol. v. 47, p. 643653, 2010.
SARLI, G. Prognostic value of histologic stage and proliferative activity in canine malignant mammary tumors. J. Vet. Diagn. Invest., v.
14, p. 2534, 2002.
SATO, H.; FUJINO, Y.; UCHIDA, K. et al. Comparison between immunohistochemistry and genetic clonality analysis for cellular
lineage determination in feline lymphomas. J. Vet. Med. Sci., v. 73, p. 9457, 2011.
SCHULMAN, F. Y. Feline peripheral nerve sheath tumors: histologic, immunohistochemical, and clinicopathologic correlation (59
tumors in 53 cats). Vet. Pathol., v. 46, p. 116680, 2009.
STEFANELLO, D.; AVALLONE, G.; FERRARI, R. et al. Canine cutaneous perivascular wall tumors at first presentation: clinical
behavior and prognostic factors in 55 cases. J. Vet. Intern. Med., v. 25, p. 1398405, 2011.
VALLI, V. E. Canine lymphomas: association of classification type, disease stage, tumor subtype, mitotic rate, and treatment with
survival. Vet. Pathol., v. 50, p. 73848, 2013.
VALLI, V. E. Veterinary Comparative Hematopathology. Blackwell Publishing Professional: Iowa, 2007. 558 p.
VALLI, V.E. Classification of canine malignant lymphomas according to the World Health Organization criteria. Vet. Pathol., v. 48, p.
198211, 2011.
WALTER, J. A cytokeratin profile of canine epithelial skin tumours. J. Comp. Pathol., v. 122, p. 27887, 2000.
WEBSTER, J. D.; MILLER, M. A.; DUSOLD, D. et al. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in
domestic animals. J. Histochem Cytochem., v. 57, p. 75361, 2009.
WERNER, M.; CHOTT, A.; FABIANO, A. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. Am J Surg Pathol.,
v. 24, p. 10169, 2000.
YANG, W. Y.; LIU C. H.; CHANG C. J. et al. Proliferative activity, apoptosis and expression of oestrogen receptor and Bcl2 oncoprotein
in canine mammary gland tumours. J. Comp Pathol. v. 134, p. 709, 2006.
ZOLA, H. Medical applications of leukocyte surface molecules, the CD molecules. Mol. Med., v. 12, p. 3126, 2006.
ZOLA, H.; SWART, B.; BANHAM, A. et al. CD molecules. Human cell differentiation molecules. J. Immunol Methods. v. 319, p. 15,
2007.
Introdução
O termo cultura de tecidos vem sendo empregado de forma genérica, sendo utilizado para se referir aos estudos com
células ou órgãos mantidos in vitro por mais de 24 h. A cultura de órgãos referese ao cultivo de fragmentos ou de um
órgão completo, com a manutenção da sua estrutura tecidual tridimensional e das funções integrais ou parciais que eram
exercidas in vivo, enquanto a cultura de células se refere a células mantidas in vitro, provenientes de desagregação
mecânica, química ou enzimática de um tecido ou órgão.
Breve histórico
O estabelecimento de técnicas para manter e cultivar células in vitro é um marco importante na evolução das Ciências
Biológicas. Desde a sua introdução em 1907, métodos têm sido desenvolvidos para elucidar questões fundamentais da
biologia celular e direcionar pesquisas na área da saúde.
A história do desenvolvimento do cultivo celular teve início com o pioneirismo de Ross Granville Harrison com o
objetivo de melhor compreender o sistema nervoso. Seus experimentos consistiam em colocar um fragmento de medula
espinal de embriões de anfíbios em linfa, vedada entre uma lamínula e uma lâmina de vidro, o qual permitiu acompanhar
por até uma semana o crescimento e a formação de fibras nervosas, identificando como ocorria a inervação dos órgãos em
direção ao sistema nervoso central.
1 Outro importante pesquisador, laureado com o prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina
em 1912 por aprimorar a técnica de cultivo celular observando os estudos realizados por Harrison, foi Alexis Carrel, que
implantou modificações inovadoras para a época no controle rígido da assepsia e na troca periódica do meio de cultura,
sendo considerado por muitos pesquisadores o descobridor da técnica de cultivo celular em virtude de seu sucesso com
células cardíacas de embrião de galinha por aproximadamente 4 semanas.
2
,
3
Neste contexto, Albert Eberling, um dos assistentes de Carrel, desenvolveu a técnica de subcultivo de células do coração
de embrião de galinha, repetindo o processo por 34 anos e criando a lenda do coração imortal de galinha. A desagregação
das células de explante (fragmento de tecido retirado de um órgão) por tripsina (enzima que age na quebra de proteínas) e o
posterior plaqueamento das células dispersas em garrafas de cultivo foram demonstrados pela primeira vez por Peyton
Rous e Fred Jones em 1916.
2
,
3
Em 1923, Carrel desenvolveu os primeiros frascos de cultura, circulares e de vidro. Em 1948, Keilova introduziu o uso
de antibióticos para a manutenção das culturas. Somente na década de 1950 a tripsina se tornou amplamente utilizada para
expansão de subculturas, seguindo procedimentos descritos por Dulbecco em culturas em monocamada para facilitar as
clonagens de células por ensaios virais. Os primeiros modelos tridimensionais testados por Joseph Leighton surgiram em
1951, com intuito de minimizar as limitações de um cultivo celular em monocamada e aproximálo da estrutura observada
em um organismo vivo.
1,2,4
George Gey apud Collins, em 1952, estabeleceu uma linhagem contínua de células derivadas de um câncer de cérvice
humano, retiradas de uma mulher afroamericana de 31 anos chamada Henrietta Lacks, atualmente conhecida como a
■
linhagem HeLa. Utilizada até hoje em todo o mundo, demonstrou que tumores humanos apresentam características
heteroaploides, em que o número de cromossomos varia de uma célula para outra, o que aumentou ainda mais o interesse
pelo cultivo celular.
5
Eagle e Dulbecco et al. apud Alberts et. al e Cruz et al., em 1955, fizeram a primeira investigação sistemática dos
nutrientes essenciais para o cultivo celular e descobriram que células eucariotas poderiam se propagar em uma mistura de
aminoácidos com uma pequena proporção de proteínas séricas, desenvolvendo a base dos meios de cultura utilizados
atualmente. Em 1961, Hayflick e Moorhead apud Alberts et al. e Cruz et al. mostraram que fibroblastos humanos em
cultura continham um número finito de divisões celulares. Desse modo, muitas linhagens foram estabelecidas por
pesquisadores com o intuito de desvendar os processos individuais de cada sistema. Em 1962, Nakamura et al. apud
Alberts et al. e Cruz et al. estabeleceram a linhagem VERO, oriunda de rim de macacoverde africano
(Cercopithecusaethiops), que se tornou um excelente modelo para o desenvolvimento de vacinas aprovadas pela
Organização Mundial da Saúde (OMS).
1
,
6
Graham e van der Eb apud Robertis e Evans et al., em 1973, desenvolveram um método para introdução de DNA
humano em culturas de células de ratos. Já Köhler e Milstein apud Robertis e Evans et al., em 1975, produziram o
primeiro hibridoma de linhagens celulares capazes de secretar anticorpos monoclonais. Enquanto, em 1976, Hayashi e Sato
apud Robertis e Evans et al., mostraram que cada tipo celular necessita de uma mistura diferente de hormônios e fatores de
crescimento para se desenvolverem em um meio não suplementado. A partir dos anos 1980, grandes progressos foram
observados no cultivo celular para confirmar a importância dessa metodologia, na qual foram identificados por Evans et al.
em 1983 alguns dos principais reguladores do ciclo celular.
2
,
7
Incentivados inicialmente pelos estudos de Martin et al. apud Freshney em 1986, os estudos em cultivo celular também
identificaram células com grande potencial de diferenciação, em que célulastronco embrionárias pluripotentes de
camundongos foram isoladas e cultivadas. Célulastronco mesenquimais de humanos adultos e embrionárias foram
isoladas e cultivadas por Caplan, em 1991, e Thomson et al. apud Freshney, em 1998, respectivamente.
8
Com a evolução da Medicina e das tecnologias de informação, as pesquisas no campo científico foram sendo ainda mais
incentivadas a partir dos anos 2000. O Projeto Genoma Humano reuniu esforços internacionais para o mapeamento do
genoma da espécie humana e a identificação de todos os nucleotídeos que o compõem. Após iniciativa dos Institutos
Nacionais da Saúde (NIH) dos EUA, centenas de laboratórios de todo o mundo se uniram à tarefa de sequenciar, um a um,
os genes que codificam as proteínas do corpo humano e também aquelas sequências de DNA que não são genes.
As tecnologias em cultivo celular também foram adotadas em muitas aplicações de rotina em Medicina e na indústria. A
análise cromossômica de células derivadas de placenta coletadas por amniocentese pôde identificar doenças genéticas em
bebês durante o seu desenvolvimento uterino. Efeitos tóxicos de compostos farmacêuticos e o potencial de poluentes
ambientais puderam ser medidos em ensaios in vitro. Da mesma forma, produtos celulares, como o hormônio de
crescimento humano, a insulina e a interferona, agora são produzidos rotineiramente por células modificadas com genes
específicos. Aplicações em fertilização in vitro também foram desenvolvidas a partir de experimentos em cultura de
embriões, agora amplamente utilizados em muitos países. Além disso, o desenvolvimento de gametas in vitro a partir da
cultura de células germinativas primordiais, isoladas em testículos e ovário ou a partir de célulastronco embrionárias, tem
sido alvo de estudos.
Avanços substanciais foram observados ao longo dos anos, e, atualmente, estudos têm sido direcionados para a avaliação
do perfil proteômico e metabolômico dos organismos. De uma forma interessante, ações inovadoras têm sido exploradas na
engenharia de tecidos com a aplicação da bioimpressão automatizada de tecidos e órgãos humanos baseada na estruturação
por blocos de construção conhecidos como esferoides teciduais, utilizando impressoras 3D, em que esferoides contendo
células vivas sofrem um processo de fusão natural e o tecido/órgão recémfabricado é levado a um sistema de cultivo que
deverá prover as condições necessárias para a maturação do novo órgão antes de este ser implantado no paciente.
Desse modo, a cultura celular não permite somente a avaliação direta, independente e restrita de um único tipo celular,
mas também é possível observar a interação célulacélula e sua importância no organismo.
Classificação das culturas celulares
As culturas celulares podem ser classificadas quanto ao tipo de ancoragem das células, podendo ser aderentes ou não
aderentes e, quanto à sua origem e o número de divisões celulares, como cultura primária ou de linhagem contínua.
Células aderentes e não aderentes
Dependendo do tecido de origem, as células podem crescer tanto suspensas no meio de cultura quanto aderidas, formando
monocamadas em superfície sólida. Na cultura em monocamada, as células aderem ao substrato, prérequisito
■
■
indispensável à proliferação celular. O frasco de cultivo deve ser tratado por ionização para estimular o processo de adesão
celular, cuja produção de integrinas, proteoglicanos, microfilamentos, moléculas de adesão (CAM) dependentes ou não
dependentes de cálcio e outros interagem com o citoesqueleto celular, promovendo a ligação célulacélula e célulaarcabouço.
O crescimento em monocamada é observado na maioria das culturas de células normais com exceção das células
provenientes do tecido hematopoético, de tecido tumoral em processo de metastatização e aquelas circulantes oriundas do
sistema imune, cujas células crescem em suspensão de células individuais não aderidas ou em esferas (Figura 10.1).
Figura 10.1 Imagens de células em cultivo. A. Células de cultura primária de fibroblastos provenientes de explante de
tumor mamário canino (indicado pela seta). B. Células aderentes em monocamada da linhagem tumoral mamária canina,
CMTU229, cedidas pela Dra. Eva Hellmén da Universidade de Uppsala, Suécia. C. Células em suspensão provenientes da
linhagem MDAMB231 para formação de mamosferas, obtida pelo banco de células ATCC. D. Mamosferas da linhagem
CMTU229. Imagens cedidas pelo Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC/FAMERP).
Células primárias
As células primárias são obtidas diretamente de organismos vivos, em que o tecido separado em condições assépticas é
fragmentado em pequenos pedaços e submetido a um tratamento enzimático (tripsina, colagenase, elastase, hialuronidase e
outros) ou mecânico para dissociarse dos agregados celulares e gerar uma suspensão de células livres, devendo ser
cultivado em recipiente e meio de cultura apropriados. Com a proliferação celular e o aumento do número de células, as
culturas primárias necessitam ser subcultivadas ou repicadas. Apesar disso, esse tipo celular permite um número limitado
de divisões, sem grandes alterações morfológicas.
Um dos principais desafios na realização da cultura primária a partir de tumores caninos é a manutenção de um cultivo
sem contaminação, uma vez que a maioria dos tumores desses animais é retirada cirurgicamente após um longo período de
evolução clínica e se apresenta ulcerada e contaminada, o que será um grande fator limitante no estabelecimento do cultivo
celular.
Células transformadas ou de linhagem contínua
À medida que o cultivo primário é subcultivado e as células mais resistentes sobrevivem aos processos de repique e
senescência, as células com maior capacidade proliferativa predominam no cultivo, mantendo as características do tecido de
origem em células mais homogêneas, com alto índice de proliferação. Obtémse dessa forma uma linhagem celular por
subcultivo de uma cultura primária na qual, por seleção de uma mutação aleatória, as células são transformadas ou
imortalizadas, dando origem a uma linhagem celular contínua. Este tipo celular frequentemente está relacionado com a
tumorigênese e pode ser propagado sem perder suas características por inúmeras vezes.
Algumas células desenvolvem essa capacidade proliferativa pelo aumento da expressão de uma enzima chamada
telomerase, que tem a função de adicionar sequências específicas e repetidas de DNA à extremidade 3 dos cromossomos,
onde se encontra o telômero. A presença da sequência telomérica garante o anelamento da telomerase, que, por sua vez,
permite a replicação completa do cromossomo e sua correta distribuição espacial. Nas células normais, é natural que o
telômero diminua de tamanho durante seu ciclo de vida, em uma taxa de 30 a 120 pares de base por replicação, sendo esse
um sinal de senescência. Nas linhagens celulares imortalizadas, o comprimento dos telômeros varia com o tempo,
revelando uma atividade compensatória da telomerase.
Diversos são os mecanismos que potencializam e transformam células em linhagens contínuas por meio de técnicas de
introdução de genes virais transformantes, ligados a sequências de oncogenes, ou inativação dos mecanismos de ponto de
checagem que detêm o ciclo celular.
Linhagens celulares muitas vezes podem ser mais facilmente geradas a partir de células de câncer, mas essas culturas
diferem daquelas preparadas a partir de células normais de várias maneiras, sendo referidas como linhagens de células
transformadas. Essas linhagens frequentemente crescem sem aderir a uma superfície e podem proliferar para uma
densidade muito mais alta em uma placa de cultura. São extremamente úteis na pesquisa celular, como fonte de um grande
número de células de um tipo uniforme, especialmente por poderem ser estocadas em nitrogênio líquido a –196 °C por um
período indefinido e manter sua viabilidade quando descongeladas.
Tanto as linhagens celulares comercializadas quanto as cedidas ao laboratório de pesquisa por doação devem ser
caracteriza das com marcadores específicos, a fim de confirmar sua origem, seu fenótipo, seu grau de invasividade e a
proliferação celular para futuras aplicações.
Os bancos de células são empresas responsáveis pela caracterização das linhagens celulares, assim como pela sua
distribuição e comercialização, mantendo estoques em condiçõespadrão e respeitando normas de segurança. Atualmente,
existem bancos de células em todo o mundo que fornecem catálogos de informações dessas linhagens ou apresentam a
disponibilização dessas informações por meio da rede internacional de computadores, como o banco de células americano
American Type Culture Collection (ATCC), o banco de células do Rio de Janeiro (BCRJ/UFRJ), entre outros. Algumas
das linhagens celulares amplamente utilizadas em pesquisa estão listadas na Tabela 10.1 e ilustradas na Figura 10.2.
Tabela 10.1 Algumas linhagens celulares comumente utilizadas em pesquisa.
Linhagemcelular Origemdo tecido/Tipo celular Patologia
A2780 Ovário/Epitelial (humano) Carcinoma
A549 Pulmão/Epitelial (humano) Carcinoma
DU 145 Próstata/Epitelial (humano) Carcinoma
HepG2 Fígado/Epitelial (humano) Hepatocarcinoma
MCF10A Glândula mamária/Epitelial (humano) Fibrosecística
MCF7 Mama/Epitelial (humano) Adenocarcinoma
MDA-MB-231/ MDA-MB-468 Glândula mamária/Epitelial (humano) Adenocarcinoma
SCC-9/SCC-25 Boca/Epitelial (humano) Carcinoma
SCC-4/SCC-15 Língua/Epitelial (humano) Carcinoma
HCT116 Cólon/Epitelial (humano) Carcinomacolorretal
MDCK 60 Rim/Epitelial (canino) Normal
MDCK 1 Rim/Fibroblasto(canino) Normal
D-17 Osso/Epitelial (canino) Osteossarcoma
CRFK Rim/Epitelial (gato) Normal
CMT-U229 Glândula mamária/Epitelial (canino) Tumor mistobenigno
CF41 Glândula mamária/Epitelial (canino) Carcinoma
HT1080 Tecidoconjuntivo/Epitelial (humano) Fibrossarcoma
HeLa Cérvice/Epitelial (humano) Adenocarcinoma
HEK293 Rim/Epitelial (humano) Normal
Figura 10.2 Imagens de células aderentes em cultivo em monocamada. A. Linhagem tumoral mamária canina, CMTU229,
cedida pela Dra. Eva Hellmén da Universidade de Uppsala, Suécia. B. Linhagem tumoral mamária canina, CF41, obtida
pelo banco de células ATCC. C. Cultura primária de fibroblastos provenientes de tecido mamário tumoral canino. D.
Linhagem tumoral mamária humana não metastática, MCF7, obtida pelo banco de células ATCC. E. Linhagem tumoral
mamária humana metastática, MDAMB231, obtida pelo banco de células ATCC. F. Linhagem tumoral mamária humana
não transformada, MCF10A. G. Linhagem tumoral de fígado humana, HepG2. H. Linhagem tumoral de língua SCC4. I.
Linhagem tumoral de língua, SCC15. Imagens cedidas pelo Laboratório de Investigação Molecular do Câncer
(LIMC/FAMERP).
Biossegurança em cultivo de células
Para o sucesso da técnica de cultura de células, o cumprimento das regras e os cuidados com assepsia são fundamentais,
uma vez que cerca de 70% dos problemas que surgem estão relacionados com contaminações. Assim, o cultivo de células
deve ser realizado em condições assépticas. Para isso, vários cuidados básicos de manipulação e prevenção devem ser
tomados.
Entre os equipamentos de proteção individual que devem ser obrigatoriamente utilizados para a manipulação das células
em cultivo, estão máscara e luvas cirúrgicas, touca, propés e aventais descartáveis. Além disso, antes de iniciar a
manipulação das células em cultivo, devese realizar a higienização simples das mãos com água e sabão e antisséptica com
álcool etílico 70%, seguindo os passos de lavagem estabelecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA),
■
desde as unhas e as extremidades dos dedos até o antebraço, com a finalidade de remover a sujidade propícia à permanência
e a proliferação de microrganismos que colonizam as camadas superficiais da pele, assim como o suor, a oleosidade e as
células mortas, reduzindo a carga microbiana das mãos. Ao final, secar as mãos com papeltoalha descartável seguindo
pelos punhos e depois descartar o papeltoalha em depósito de lixo próprio para resíduos comuns e vestir luvas cirúrgicas.
Como medida de segurança, o profissional também não deve usar anéis, pulseiras, relógios, entre outros adereços que
possam entrar em contato com os materiais estéreis utilizados na manipulação das células.
Além disso, toda a superfície da área de trabalho deve ser limpa com álcool etílico 70% antes e após o desenvolvimento
de cada atividade. Assim como todo material aquecido em banhomaria deve passar por assepsia antes de ser introduzido
na cabine de segurança biológica. Devese retirar o material do banhomaria, remover o excesso de umidade com auxílio de
uma gaze ou um papel absorvente e realizar posterior limpeza com álcool etílico 70%. O álcool é eficaz na redução da flora
bacteriana da pele por ter propriedade desnaturante de proteínas, responsável por sua ação antimicrobiana.
O cultivo celular deve ser realizado em fluxo laminar ou em cabine de segurança biológica, uma capela para manipulação
de reagentes e substâncias tóxicas e voláteis, com espaço suficiente apenas para colocar os braços dentro. Antes do início
dos procedimentos, a câmara interna do fluxo deve ser limpa com gaze estéril embebida em álcool etílico 70% e o fluxo de
ar e a luz ultravioleta (UV), útil para a eliminação específica de microrganismos no ar e na água, devem ser ligados por, no
mínimo, 30 min antes do uso (Figura 10.3). Todo o material utilizado deve ser desinfetado, autoclavado e esterilizado para
minimizar as chances de contaminação, assim como o uso do fogo dentro do fluxo laminar. Durante a manipulação, a cada
retirada das mãos do espaço interno do fluxo laminar, devemse friccionar as luvas com álcool etílico 70%. Com esses
procedimentos básicos para a manipulação das células, a chance de contaminação com microrganismos pode ser evitada.
Manutenção celular in vitro
A dissociação das células dos tecidos e a separação de acordo com o tipo celular resultam em uma população celular
relativamente homogênea que pode ser analisada diretamente ou após inúmeras replicações.
Estudos de cultura celular bidimensional são frequentemente realizados em substrato sintético como vidro ou plástico,
forçando as células a ajustaremse ao plano artificial e à superfície rígida fornecida. As garrafas e os frascos utilizados para
a manutenção de células aderentes têm superfície plana, propriedades ópticas e cargas negativas, são constituídos de
poliestireno, são uniformes quanto às propriedades e à reprodutibilidade, são hidrofóbicos e previamente tratados com
químicos e radiações γ. O estabelecimento da cultura celular exige condições assépticas, regulação de temperatura,
umidade, oxigênio e gás carbônico, bem como meios de cultivo e suplementos específicos.
Condições e meios nutritivos apropriados ao cultivo celular
Para manutenção e propagação das células em cultura, é necessário mimetizar as condições fisiológicas, vias metabólicas e
bioquímicas, reproduzir as condições nutricionais, mimetizar uma atmosfera apropriada, de temperatura, umidade, oxigênio
e gás carbônico encontrados in vivo, além de ter condições de esterilidade com ausência total de microrganismos e agentes
tóxicos. As células devem ser mantidas em incubadoras apropriadas, que controlarão a temperatura geralmente em torno de
36,5°C, ter concentração de CO2 em torno de 5% e manter a umidade do ar controlada.
Em procedimentos rotineiros, como troca de meio, repique e outros, devese trabalhar utilizandose cabine de segurança
biológica, equipamento que possibilita a filtração do ar por um sistema de membranas seriadas com poros de diâmetro que
decrescem gradativamente até 0,3 μm, criandose assim um local de trabalho no qual o ar que entrará em contato com as
células estará em condições de esterilidade, evitandose possíveis contaminações. As células são frequentemente
observadas por microscópio invertido de imagem (invertoscópio; Figura 10.4).
Figura 10.3 Cabine de segurança biológica adequada para o desenvolvimento da técnica de cultivo celular. A. Câmara
interna limpa com álcool etílico 70%, fluxo de ar e luz ultravioleta (UV) ligados antes da manipulação das células em
cultivo. B. Cabine de segurança biológica com luz fluorescente acesa e pronta para a utilização. Imagens cedidas pelo
Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC/FAMERP).
É necessário o fornecimento de nutrientes específicos e em concentrações ideais para as células com o intuito de simular
as condições encontradas no tecido original. Este meio pode ser encontrado na forma em pó, altamente estável, ou, ainda,
em forma líquida. Os meios de cultivo foram estabelecidos a partir de 1950, com diferentes formulações que
proporcionassem a manutenção e o crescimento celular in vitro, como o meio 199 de Morgan de 1950, o meio CMRL de
Parker de 1957, os meios basais de Eagle de 1955 e 1959, e o meio NCTC 109 desenvolvido por Evans et al. a partir de
1956, utilizados até hoje.
Em sua composição, devem conter sais inorgânicos (como cálcio, ferro, magnésio, potássio, entre outros), aminoácidos
essenciais e não essenciais, vitaminas, proteínas, antibióticos, fontes de energia, como a glicose, hormônios ou fatores de
crescimento, condições físicoquímicas adequadas, como pH e osmolaridade, para garantir a sobrevivência celular (Figura
10.5). Antibióticos e fungicidas são utilizados nos meios nutritivos para controle da contaminação microbiológica, sendo
os compostos mais utilizados a gentamicina, a estreptomicina, a penicilina e a anfotericina.
Em acréscimo, os meios de cultivo geralmente são suplementados com 5% a 20% de soro. Este aditivo fornece
elementos essenciais ao meio de uma forma empírica, contendo: fatores de crescimento, como insulina, fator de
crescimento epidermal (EGF) e fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), que estimulam o crescimento e a
diferenciação celular, prevenindo assim os processos de apoptose; albumina, com a função de proteger as células de
choques físicos decorrentes dos processos de pipetagem e ainda como agente desintoxicante; fatores de adesão celular;
transportadores de íons de ferro, como a transferrina; além de fatores protetores (inibidores de proteases). Devese utilizar
um soro fetal certificado, estéril, inativado a 56°C por 30 min, livre de micoplasmas e sem endotoxinas. Os soros estão
disponíveis comercialmente, e os mais utilizados são de origem bovina, equina e humana.
A formulação dos meios de cultivo e dos suplementos utilizados varia de acordo com a origem celular a que se destina,
podendo ser adaptada a cada tipo celular. Para a escolha do meio de cultivo adequado a cada célula, é necessário que se
façam uma minuciosa consulta literária e uma busca de referências em bancos oficiais de células. Como exemplo, é
possível citar os meios BME (basal medium Eagle’s), EMEM (essencial minnimun with Earl’s salts medium), DMEM
(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, meio sintético complexo), RPMI 1640 (criado pelo Roswell Park Memorial
Institute, meio sintético complexo), CMRL (basal medium designed for serumfree formulations), D22 (basal medium for
insect cell culture) e HAMF12 (F12 nutrientmedium).
Figura 10.4 Esquema ilustrativo da cabine de segurança biológica (A), invertoscópio (B) e incubadora de CO2
(C) para
manutenção do cultivo celular. Imagens cedidas pelo Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC/FAMERP).
Após acréscimo de quaisquer substâncias ao meio celular, é importante rotular o frasco imediatamente, com etiquetas
que contenham informações sobre a solução preparada, o lote, a data do preparo, o prazo de validade, o nome dos técnicos
responsáveis e a temperatura de estocagem, que deve ser preconizada entre 4 e 8°C.
Principais agentes contaminantes
Manter a assepsia em cultura é algo muito difícil. O material esterilizado erroneamente, a manipulação sem cuidado e,
principalmente, a falta de higiene e de vestimenta correta dos manipuladores podem causar contaminação de uma cultura.
Embora a contaminação microbiana seja a mais comum, quando as condições de cultura já estão estabelecidas, pode
ocorrer também a contaminação química, principalmente quando se utiliza lavagem de vidrarias e materiais com água de
qualidade não apropriada. Além disso, também pode ocorrer a chamada contaminação cruzada, que é a contaminação entre
células de linhagens diferentes. A contaminação microbiana leva à perda das culturas celulares em andamento e geralmente
ocorre em razão de erros de manipulação durante a interação do pesquisador com as técnicas e condições de cultura.
Diferentes tipos de agentes podem causar a contaminação microbiana: bactérias, vírus, fungos (Figura 10.6), leveduras,
protozoários e micoplasmas.
Figura 10.5 Componentes básicos constituintes do meio de cultivo celular. CaCl2 = cloreto de cálcio; KCl = cloreto de
potássio; MgS = sulfeto de magnésio; NaCl = cloreto de sódio; NaH2PO4 = fosfato monossódico; NaHCO3 = bicarbonato de
sódio.
As bactérias são organismos procariontes com capacidade de proliferação muito rápida e que, na maioria das vezes,
conseguem crescer em qualquer condição. Elas estão presentes no ar e nas superfícies. As contaminações por bactérias e
fungos são geralmente fáceis e rapidamente detectadas em virtude da turvação do meio de cultura, da alteração do pH pela
capacidade de metabolizar o meio de cultura tornandoo excessivamente ácido, da rápida morte celular e da presença de
partículas em suspensão. Assim, uma contaminação bacteriana inviabiliza a utilização da cultura celular, visto que elas
competem pelos nutrientes do meio fazendo com que as células morram por causa da falta de alimento, alterando o
metabolismo celular e diminuindo consequentemente a viabilidade. A presença de micélios filamentosos de fungos é
facilmente observada em um frasco de cultura.
Micoplasmas são microrganismos procariotos desprovidos de parede celular que contêm uma membrana lipídica em
bicamadas, imperceptíveis na visualização por microscópio óptico invertido, sendo os contaminantes mais comuns na
cultura de células. As contaminações por vírus e micoplasmas geralmente ocorrem de forma mais lenta, podendo apresentar
período variável de latência, com diminuição gradativa do crescimento celular até a perda das culturas. No caso dos vírus,
às vezes é possível a observação de regiões de morte celular nas culturas, enquanto nos micoplasmas a detecção visual da
contaminação não é possível. Para diagnóstico de contaminação por esses agentes, existem testes que utilizam a
imunofluorescência ou a marcação de proteínas específicas.
Em casos de contaminação, é importante fazer a rastreabilidade, avaliando as condições e o ambiente nos quais a célula
foi cultivada, os meios e as soluções utilizados e a paramentação do pesquisador responsável pela manipulação e a revisão
das técnicas e dos procedimentos. Isso impede que, em caso de contaminação pontual, esta se espalhe para outras culturas
do laboratório, além de permitir a investigação dos principais motivos da contaminação, a fim de eliminála. Nesse sentido,
a esterilidade deve ser garantida por meio da qualidade das soluções e do material utilizado e do bom treinamento dos
técnicos.
Tripsinização celular
Após determinado tempo em cultivo, as células estabelecem contato umas com as outras e os nutrientes disponíveis para a
manutenção das células podem não ser mais suficientes para a densidade celular. Assim, há necessidade de proceder
subculturas sucessivas. O primeiro passo no isolamento de células individuais é romper a matriz extracelular e as junções
entre as células que as mantêm unidas. Com esse propósito, um tecido normalmente é tratado com enzimas proteolíticas
(como tripsina e colagenase) para digerir as proteínas na matriz extracelular e com agentes (como o ácido
etilenodiaminotetracético, ou EDTA) que ligam ou quelam o Ca
2+
, do qual a adesão entre as células depende.
O processo de renovação de células de uma garrafa a outra é chamado passagem. O número de passagens se refere ao
número de vezes que essa cultura foi subcultivada. Muitas linhagens contínuas são capazes de manter as características
iniciais do tecido original com algumas passagens, enquanto as células transformadas não mantêm as mesmas
características e são capazes de permanecer em cultura por um grande número de passagens (chegando até virtualmente ao
infinito número de passagens).
Para as células não aderentes, o procedimento de passagem se assemelha a uma diluição, e basta retirar células da garrafa
de cultivo, adicionando novo meio ao seu lugar. Isso ocorre porque essas células se encontram em suspensão no meio,
sendo possível retirálas sem que seja necessário um procedimento específico.
Para as células aderentes, são necessários processos de dissociação mecânica (raspadores) ou enzimática (por ação da
tripsina) para estabelecimento de nova cultura celular. A desagregação mecânica pode ser feita por compressão das células
contra uma peneira com malha de diâmetro sucessivamente menor, passando as células por meio de uma seringa e uma
agulha ou simplesmente pipetando repetidamente. Esta técnica tem a vantagem de ser mais rápida do que a dissociação
enzimática, embora cause mais lesões mecânicas às células.
A desagregação enzimática ocorre pela digestão das proteínas de adesão por proteases, ocasionando a dissociação da
matriz e a quebra das proteínas de contato célula/célula, sem comprometer a membrana ou danificar a superfície celular. A
tripsina, enzima proteolítica inespecífica, hidrolisa cadeias polipeptídicas nos radicais lisilarginil, formando terminações
de clivagem, éster e amida, desestruturando assim a matriz, obrigando as células a restabelecerem os rearranjos do
citoesqueleto. Sua atividade residual pode ser neutralizada por intermédio do soro do meio de cultura ou por meio de um
inibidor sintético adicionado.
Figura 10.6 Esquema ilustrativo de garrafa de explante celular em cultivo. A. Cultivo primário livre de contaminação. B.
Cultivo primário com contaminação fúngica. Imagens cedidas pelo Laboratório de Investigação Molecular do Câncer
(LIMC/FAMERP).
Contagem celular em hematímetro de Neubauer
A viabilidade celular e as condições de crescimento são controladas por meio da quantificação celular; além disso, diversos
experimentos necessitam de número preciso de células para novo plaqueamento. A forma direta de contagem de células
consiste na contagem direta no frasco de cultivo, e a forma indireta é feita por quantificação de determinadas estruturas
celulares, como proteínas ou medição do metabolismo celular.
O método mais utilizado na quantificação direta é a contagem em câmara de Neubauer. A câmara de Neubauer é uma
lâmina de vidro com divisões que auxiliam na contagem; ela contém 9 quadrados que medem 1 mm
2 de área, e somente os
quatro quadrados externos são utilizados na contagem de células. Cada quadrado externo é formado por mais 16 quadrados
menores que auxiliam a contagem (Figura 10.7 A). É necessário acoplar uma lamínula de vidro sobre a câmara, a fim de
conter a suspensão celular; o espaço formado entre a lamínula e a câmara é de 0,1 mm. Dessa forma, o volume
determinado por cada quadrado é equivalente a 0,1 mm
3 e as células contadas em um quadrante, ressuspensas em 1 mℓ de
meio de cultivo, equivalem ao valor de células contado, multiplicado por 10
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