além de fornecer o estadiamento oncológico preciso, uma vez que representa um diferencial quando comparado à

linfadenectomia aleatória, em que o patologista deve examinar os linfonodos sem a devida convicção de que sejam estes os

que drenam o sítio neoplásico primário.

Além disso, a aplicação da técnica permite tratamento mais adequado, com bons índices de controle neoplásico e

aumento na sobrevida dos animais.

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Introdução

A imuno­histoquímica é uma técnica que permite a localização e a visualização de um antígeno in situ, em cortes

histológicos processados de forma rotineira, ou seja, em material fixado em formol e incluído em parafina, bem como em

tecidos de congelação e preparados citológicos.

A vantagem da técnica de imuno­histoquímica é a associação da visualização do antígeno a ser pesquisado com sua

localização no tecido, o que difere de métodos que têm a capacidade de determinar a presença do antígeno e quantificá­lo

(p. ex., citometria de fluxo, Western blot), porém sem a possibilidade de se conhecer o tipo celular que o expressa.

De forma resumida, o método imuno­histoquímico se baseia no uso de anticorpos primários contra antígenos a serem

identificados em tecidos, em cortes histológicos.

Em 1981, Hsu et al. descreveram a técnica conhecida como método Avidina Biotina Peroxidase (ABC), que se baseia na

aplicação de um anticorpo secundário biotinilado, direcionado contra a espécie animal em que foi produzido o anticorpo

primário, e, no posteriormente, uso de um complexo contendo avidina­biotina e peroxidase. Este, pela afinidade entre a

avidina e a biotina, liga­se ao anticorpo secundário biotinilado. As moléculas de peroxidase recebem elétrons de um

cromógeno (Diaminobenzidina – DAB ou AEC – 3­amino, 9­etil carbazol), que se coram de castanho (DAB) ou vermelho

(AEC), sendo este o resultado final da imuno­histoquímica.

1

Anticorpos

Os anticorpos primários são de dois tipos: monoclonais ou policlonais. O primeiro deles reage contra um único epítopo

antigênico, sendo produzido, normalmente, em camundongos e coelhos. Os anticorpos policlonais reagem contra diferentes

epítopos, do mesmo antígeno, e a maior parte é produzida em coelhos.

Os anticorpos monoclonais são mais específicos do que os policlonais, porém a chance de reação cruzada com as

diferentes espécies animais é menor do que a dos policlonais, o que pode dificultar o uso de anticorpos monoclonais

comerciais, a maioria direcionada contra epítopos de tecidos humanos, no estudo imuno­histoquímico em Medicina

Veterinária.

Os anticorpos secundários devem ser direcionados contra a espécie em que foi produzido o anticorpo primário,

produzido em uma terceira espécie animal. Por exemplo: pesquisa do imunofenótipo nos linfomas caninos. O anticorpo

primário direcionado contra linfócitos T pode ser monoclonal, produzido em camundongos; o secundário – antiimunoglobulinas de camundongo – pode ser produzido em caprinos, suínos ou equinos.

Esses anticorpos secundários, também denominados sistemas de detecção, podem ser biotinilados (usados nos kits

comerciais ABC, LSAB) ou ligados a um polímero que tem a ele aderido moléculas de peroxidase ou fosfatase alcalina.

Diagnóstico

O uso de métodos para melhor exposição de antígenos nas amostras teciduais, antes da reação antígeno­anticorpo

propriamente dita, revolucionou a imuno­histoquímica diagnóstica. Métodos de recuperação de epítopos baseados em calor

(Heat­Induced Epitope Retrieval, ou HIER) melhoraram a qualidade da imunocoloração de diversos anticorpos primários

utilizados no diagnóstico das doenças oncológicas. Várias opções de HIER são descritas, como vaporizador, panela de

pressão e forno de microondas. Em geral, na bula dos anticorpos primários vendidos comercialmente, há orientação sobre

qual método de recuperação antigênica deve ser utilizado para cada anticorpo em particular.

No entanto, a maioria dos anticorpos utilizados na rotina diagnóstica em pequenos animais é fabricada para funcionar em

tecidos humanos, sendo fundamental padronizar os tipos de recuperação antigênica (soluções básicas ou ácidas) para que se

obtenha uma adequada reação cruzada do anticorpo primário com o tecido animal.

Existem outros métodos de recuperação antigênica, por exemplo, por digestão enzimática com a utilização de proteinase

K. Há também, porém em número bem reduzido, anticorpos primários que não necessitam de recuperação antigênica. É

importante que o patologista esteja familiarizado com a padronização das diversas técnicas de realização do exame imunohistoquímico para a adequada análise da imunocoloração específica para cada anticorpo.

Ainda existem anticorpos primários que somente reagem em cortes de congelação, que não foram submetidos à fixação

em formol. Este procedimento é mais difícil de ser aplicado na rotina de um serviço de patologia e tem seu uso limitado.

Uma boa técnica histológica é essencial para o diagnóstico das neoplasias. A formalina, o mais comum e prático fixador

de amostras teciduais disponível, permite boa análise histológica e adequada preservação da antigenicidade para a análise

imuno­histoquímica. O ideal é utilizar formalina tamponada a 10% (Tabela 9.1) como fixador universal. Para fixar

amostras teciduais, é necessário que o fixador tenha um pH semelhante ao do sangue. Isso evita que uma solução ácida ou

alcalina venha a alterar os tecidos e prejudicar futuras análises diagnósticas ou prognósticas, especialmente em exames de

imuno­histoquímica e de biologia molecular.

Outro fator importante é o período de fixação na formalina tamponada a 10%. Geralmente, um período de 24 a 72 h é o

ideal para que as reações de imuno­histoquímica e de biologia molecular apresentem bons resultados. Amostras teciduais

que permanecem por tempo prolongado na formalina perdem a reatividade. O inverso também é verdadeiro; amostras

pouco fixadas sofrem autólise e destruição dos epítopos antigênicos.

Tabela 9.1 Receita para confecção de solução de formalina tamponada a 10%.

Reagentes Quantidade (preparo de 1 ℓ) Quantidade (preparo de 10 ℓ)

Soluçãodeformaldeído(37%) 270 mℓ 2.700 mℓ

Água 쬡ltrada 730 mℓ 7.300 mℓ

Fosfato monobásicodesódio 4g 40g

Fosfatodibásico(anidro)desódio 6,5g 65g

Atualmente, no diagnóstico oncológico, a técnica de imuno­histoquímica pode ser usada no diagnóstico de neoplasias

indiferenciadas, no imunofenótipo das células neoplásicas, na determinação da origem de metástases, como fator

prognóstico e avaliação da terapêutica instituída.

Muitos anticorpos utilizados no diagnóstico oncológico usam a nomenclatura CD. A abreviação CD origina­se do inglês

cluster of dif erentiation ou cluster of designation e significa grupo de diferenciação, sendo introduzida na literatura para

racionalizar a descrição e a identificação de moléculas da superfície celular utilizadas como alvo de imunofenotipagem.

Inicialmente, foi utilizada para leucócitos e, posteriormente, ampliada para outras populações celulares. Fisiologicamente,

as moléculas CD atuam, principalmente, como receptores encontrados na membrana celular, e outras têm função, por

exemplo, de adesão celular. O número de moléculas CD descrito na literatura médica humana atualmente é superior a 350.

Nem todos os anticorpos produzidos contra moléculas CD funcionam em tecido fixado em formalina e incluído em

parafina. Dos anticorpos que não funcionam em blocos de parafina destacam­se alguns marcadores para as doenças

histiocíticas e linfoides dos cães e gatos.

A Tabela 9.2 apresenta uma lista dos principais anticorpos primários utilizados no diagnóstico oncológico pela técnica de

imuno­histoquímica.

O exame imuno­histoquímico é um exame complementar que pode fornecer informações adicionais, não devendo ser

utilizado como única ferramenta diagnóstica das neoplasias. A solicitação de um exame de imuno­histoquímica deve ser

baseada em um diagnóstico presuntivo, com um diagnóstico morfológico sólido feito pelo exame histopatológico. Também

deve ser indicado para avaliação de fatores prognósticos, como nos mastocitomas caninos, e preditivos, frente a um

diagnóstico já estabelecido.

A técnica de imuno­histoquímica deve ser aplicada na forma de painéis de anticorpos primários (marcadores), mas, por

meio de outras técnicas, o diagnóstico pode ser feito por exclusão, com a negatividade para os anticorpos testados, por

exemplo, por falta de um anticorpo primário específico para determinado tipo celular.

Tabela 9.2 Principais anticorpos primários utilizados no diagnóstico das neoplasias.

ACTH Marcadordegrupodetumoresde hipó쬡se

Actinamuscular alfa Mio쬡lamentocitoplasmáticocom expressãoem músculoliso, células mioepiteliaise mio쬡broblastose neoplasias

relacionadas (liomiossarcomaetumores cutâneosdeparedeperivascular)

Alfainibina Marcadordetumoresdecélulasdagranulosaetumoresdocórtexadrenal

BCL-2 Oncoproteínacodi쬡cadapelogene BCL-2envolvidocom açãoantiapoptótica. Utilizadaparadistinçãoentrelinfoma

foliculare hiperplasialinfoidefolicular reativa

Calponina Marcador mioepitelial

Calcitonina MarcadordecélulasCdatireoideecarcinoma medulardatireoide

Calretinina Marcadorde mesotelioma, tumoresdecélulasdeSertoli-Leydigeameloblastomas

CD117 Proto-oncogeneC-KITouproteínatirosinoquinasekit, marcadordetumorgastrintestinalestromal, mastocitoma

(painelprognósitco)eseminoma

CD11 d Marcadordesarcoma histiocíticoeritrofagocitário

CD163 Marcadordesarcoma histiocítico

CD1a Marcadorde histiocitoma(especí쬡coanticanino,utilizadoem tecidocongelado)

CD20 Marcadordelinhagem linfoide B,persistindoem algunsplasmócitos. Marcadordelinfomas B ealguns

plasmocitomas

CD204 Marcadordesarcoma histiocítico

CD3 ReceptordelinfócitosTcadeiaépsilon. MarcadordelinfomasdecélulasT

CD31 Moléculadeadesãocelularendotelialplaquetária. Marcadorde hemangiossarcoma

CD45 Marcadorde neoplasias hematopoéticas. Utilizadoparadiferenciar neoplasias linfoidesdeoutralinhagem

CD45RA Antígenodelinhagem B eTnaive.Especí쬡coanticanino,utilizadoem painéisdiagnósticosdeTVTeplasmocitoma

(CD45positivo)e histiocitoma(CD45RA negativo)

CD56 Moléculadeadesãodecélulas neuraise neuroendócrinas.

CD79a Expressãoem células linfoidespré-B, linfócitos B maduros,persistindoem algunsplasmócitos. Marcadorde

linfomas B ealgunsplasmocitomas

CD10 Marcadorparasubgrupodelinfomas, carcinomadecélulas renaisecélulas mioepiteliais nodiagnósticodiferencial

delesõesbenignase malignasda mama

Citoqueratina Clone34bE12. Marcadordecarcinomadecélulasescamosasedecélulasbasaisdepróstata

Citoqueratina 19

Citoqueratinadebaixopeso molecularexpressaem epitéliosescamosos,basaleductal. Utilizadaem painéis

diagnósticosdetumorespancreáticos, hepáticos,datireoideeovarianos

Citoqueratina 20 Marcadordeepitéliointestinalegástrico,urotélio, célulasde Merkele neoplasias relacionadas

Citoqueratina 7 Marcadordeepitélioductal,glandular,escamososuper쬡cialedetransiçãoe neoplasias relacionadas

Pancitoqueratina Clone AE1AE3. Marcadordecarcinomasem geral

Cromogranina Marcadordetumores neuroendócrinos

Desmina Marcadordetumoresde musculaturalisaeesquelética(liomiossarcomaserabdomiossarcomas)

E-caderina Moléculadeadesãocelulare marcadordecélulasdeLangerhans na maioriados histiocitomas

NSE Utilizadaem painéisparaodiagnósticodos melanomas,gangliomas,gliomasedofeocromocitoma

Fator de vonWillebrand (Fator VIII) Marcadordecélulasendoteliais,utilizado nodiagnósticode hemangiossarcomas

FSH Marcadordegrupodetumoresde hipó쬡se

Gastrina Marcadordegrupodetumoresdecélulasdeilhotaspancreáticasegastrinomas

GFAP Proteínaácida 쬡brilarglial. Utilizadaem painéisdiagnósticosdetumoresdebainha neuralperiféricaetumores

neurais

Glucagon Marcadordegrupodetumoresdeilhotaspancreáticas

HLA-DR Complexoprincipalde histocompatibilidade MHCII. Utilizadoem painéisdiagnósticosde neoplasias histiocíticase

TVT

Insulina Marcadordegrupodetumoresdeilhotaspancreáticas

Ki67 Antígenodeproliferaçãocelular. Marcadordeproliferaçãocelular (célulasem fases não G0)

Lisozima Marcadordegranulócitos, histiócitoseleucemias mieloides

Melan A Marcadorde melanomasetumordocórtexadrenaledeestromaovariano

MyoD Marcadorderabdomiossarcoma

MUM1 Marcadordeplasmocitomae mieloma múltiplo

Neuro쬡lamentos Marcadordetumores neuronais

PTH Marcadordeadenomaecarcinomadeparatireoide

Pax5 Proteínaativadoraespecí쬡cadecélula B (BSAP). Marcadordelinfomasdecélulas B

PNL2 Marcadorde melanomas

Polipeptídio pancreático Marcadordetumorespancreáticos

PSA Marcadordetumoresprostáticos

Receptor de androgênio Marcadordetumoresprostáticos

Receptor de estrógeno Tumoresde mamaealguns carcinomas

Receptor de progesterona Tumoresde mamaealguns carcinomas

S-100 Marcadordecélulas neurogliais,ependimárias, melanocíticasecélulasdeSchwann

Sinapto쬡sina Marcadordetumores neuroendócrinos

Somatostatina Marcadordegrupodetumoresdecélulasdeilhotaspancreáticaseoutros tumores neuroendócrinos

Tireoglobulina Marcadordetumores folicularesdatireoide

Triptase Marcadordeleucemiase mastocitoma

TTF-1 Fatordetranscriçãotireoidiano. Marcadordecarcinomasdepulmãoetireoide

Uroplaquina Marcadordecarcinomaurotelial

Vimentina Marcadordesarcomasem geral

WT-1 Produtodegenesupressordetumor. Marcadorde mesoteliomaetumoresepiteliaisovarianos

Adaptadade Dabbs D,2006.

2 NSE = enolase neuronalespecí쬡ca;FSH = hormôniofolículo-estimulante;PTH = paratormônio;PSA = antígenoprostáticoespecí쬡co.

Nas neoplasias indiferenciadas e na determinação do imunofenótipo de certos tipos de câncer, um painel com anticorpos

primários deve ser usado.

Para instituir um painel de anticorpos primários de neoplasias indiferenciadas, estas devem ser classificadas de acordo

com o tamanho e o tipo de célula, e a experiência do patologista é fundamental para que o número de anticorpos primários

usados seja o menor possível. Nas Figuras 9.1 a 9.4, encontram­se as indicações de painéis de diagnóstico de algumas

neoplasias de cães e gatos.

As neoplasias primárias e suas metástases mantêm a expressão de filamentos intermediários, que são estruturas, como

os microtúbulos e microfilamentos, que formam uma rede de sustentação no citoplasma celular, sendo específicos para

cada tipo celular, o que permite o uso de anticorpos primários contra essas proteínas na caracterização de tumores

malignos, especialmente os anaplásicos.

Figura 9.1 A e B. Organogramas de anticorpos utilizados no diagnóstico imuno­histoquímico de linfomas de células B e T.

Figura 9.2 Organograma de anticorpos utilizados no diagnóstico imuno­histoquímico de plasmocitomas cutâneos.

Figura 9.3 Organograma de anticorpos utilizados no diagnóstico imuno­histoquímico de mastocitoma cutâneo canino.

Figura 9.4 Organograma de anticorpos utilizados no diagnóstico imuno­histoquímico de histiocitoma canino.

Existem cinco tipos de proteínas de filamentos intermediários. A maioria das células mesenquimais contém a vimentina

como um dos principais filamentos intermediários; as células musculares têm a desmina; e os astrócitos, a proteína ácida

fibrilar glial (GFAP). As células epiteliais contêm um sistema de filamentos intermediários mais complexos composto de

citoqueratinas.

Alguns tumores histologicamente indiferenciados podem ser submetidos à técnica de imuno­histoquímica a fim de,

inicialmente, determinar­se a origem epitelial (uso de painel de anticorpos anticitoqueratinas­CK) ou mesenquimal

(anticorpo antivimentina) (Figura 9.5). A partir desse ponto, pode­se aprofundar na origem do tipo de epitélio

(citoqueratina positivo) por meio do uso de anticorpos contra citoqueratinas de diferentes pesos moleculares, específicas

para cada tipo de epitélio (Tabela 9.3), ou de proteínas relacionadas ao tecido mesequimal (alfa­actina muscular, por

exemplo em linhagem muscular lisa), se vimentina positivo.

Para tumores de origem epitelial, pode­se citar o uso de citoqueratinas (CK7 e CK20) na diferenciação do sítio primário

dos carcinomas, e principalmente de adenocarcinomas (Tabela 9.4). Esses dois tipos de citoqueratina apresentam

distribuição peculiar em epitélios de revestimento normais e nos carcinomas correspondentes. Quando avaliada

simultaneamente e de maneira racional, a imunorreatividade de CK7 e CK20 pode contribuir na identificação do sítio

primário de vários carcinomas e adenocarcinomas.

Figura 9.5 Canino. Massa na região óssea (sacro). Metástase óssea. Carcinoma de origem primária desconhecida. A.

Células neoplásicas negativas para vimentina. B. Células neoplásicas positivas para pancitoqueratina (AE1/AE3). C.

Pancitoqueratina (AE1/AE3), com mais detalhe das células positivas (seta) em meio à matriz óssea. Imuno­histoquímica,

polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.

Tabela 9.3 Painel de anticorpos para tumores de origem epitelial, de acordo com o tipo tumoral.

Tumor MNF116 AE1/AE3 CK7 CK20 CK5/6 34βE12 E-caderina Vimentina

Ameloblastoma

acantomatoso

P N N N P P P P

Adenocarcinoma

desacoanal

P P N N N BM P N

Adenocarcinoma

ceruminoso

P P P N Células

basais

Células

basais

P V

Tumorde

folículopiloso

P V N N V P P N

Carcinoma

basocelularP

P BM N N P BM P N

Carcinoma

espinocelular

P P BM N P BM P N

Adenocarcinoma

sebáceo

Célulasbasais N N N Células

basais

P P N

Adenocarcinoma

perianal

Célulasbasais N N N Células

basais

P P N

Carcinomarenal P P V N N V P P

Adenocarcinoma

pulmonar

P P P N V

# V

#

P P

Adenocarcinoma

gastrintestinal

P* P BM** P N V P V

Adenocarcinoma

mamário

P P V N Células

basais

Células

basais

P V

Carcinoma

hepatocelular

BM N N N N N P N

Carcinomabiliar P P P BM N BM P N

Carcinoma

pancreático

P P P N N N P N

Carcinoma

endometrial

P P P P N BM P N

* nãogástrico;**gástrico;#diferenciaçãoescamosa;P = positivo; N = negativo; V = variável; BM = baixa marcação.

Tabela 9.4 Uso de CK7 e CK20 no diagnóstico dos adenocarcinomas

Local Porcentagem(%)

CK7+ CK20+

Ovário mucinoso 90

Céls.detransição 65

Pâncreas 65

Colângio 65

Gástrico 40

Exclui carcinoideespinocelulare hepatocelular,pequenas célulaspulmonar,

ovário não mucionoso, renal

< 5

CK7+ CK20-

Ovário não mucinoso 100

Tireoide 100

Mama 90

Pulmão 90

Útero 85

Mesotelioma 65

Céls.detransição 35

Pâncreas 30

Colângio 30

Exclui colorretal,ovário mucinoso, seminoma < 5

CK7-CK20+

Colorretal 80

Céls. Merkel 70

Gástrico 35

Exclui mama, carcinoidepulmonar, colângio, célulasescamosas,pulmonares

(todosos tipos), hepatocelular,ovário,pâncreas, renal,decélulasdetransição,

útero

< 5

CK7-CK20-

Adrenal 100

Seminoma 95

Próstata 85

Hepatocelular 80

Renal 80

Carcinoide GIepulmonar 80

Pequenas célulaspulmonares 75

Escamosodoesôfago 70

Escamosodecabeçaepescoço 70

Mesotelioma 35

Exclui mama, colângio,pulmão,ovário,pâncreas, célulasdetransição < 5

Adaptadade Dabbs D,2006.

2

Em relação às neoplasias de origem mesenquimal, é importante a diferenciação entre os tumores considerados sarcomas

cutâneos e subcutâneos de partes moles

3 daqueles que não estão nesta categoria, já que os sarcomas de partes moles têm

baixo potencial metastático, porém são localmente agressivos. Neste caso, a avaliação das margens cirúrgicas é mais

importante que o tipo específico de sarcoma de partes moles.

Entre os sarcomas com maior potencial metastático e pior prognóstico, é possível citar os sarcomas histiocíticos, o

hemangiossarcoma, o osteossarcoma e o melanoma. Pode­se usar um painel para diferenciação do tipo celular, com o uso

de marcadores miogênicos (desmina, alfa­actina muscular, calponina e miogenina) (Figura 9.6), de origem vascular e

parede perivascular (fator VIII, CD31, Fli­1 e alfa­actina muscular) (Figura 9.7), além dos associados à bainha neural

(S100, GFAP e CD56) (Figura 9.8).

As neoplasias melanocíticas são comumente diagnosticadas em cães, e o melanoma é referido como a neoplasia maligna

mais comum em cavidade oral nos caninos. Os principais marcadores para o diagnóstico das lesões melanocíticas de cães e

gatos são o Melan A ou MART­1, anticorpo monoclonal que reconhece proteína específica de diferenciação melanocítica, o

PNL2, também denominado antígeno melanocítico, e o S100, proteína expressa em muitas células, incluindo os

melanócitos (Figuras 9.9 e 9.10).

Como fator prognóstico dos melanomas, a taxa de proliferação celular, avaliada pelo anticorpo Ki67, é indicada. O valor

de corte para o Ki67 é de 19,5 para melanomas orais

4

, e para as lesões melanocíticas cutâneas, acima de 15% de

positividade para o Ki67 confere pior prognóstico.

5,6

Nos cães, o diagnóstico de tumores de células redondas, baseado na histopatologia, é desafiador. Neoplasias de células

redondas podem apresentar­se morfologicamente semelhantes, principalmente em tumores pouco diferenciados. O uso da

imuno­histoquímica nesses casos é de grande auxílio para o diagnóstico diferencial e consequente determinação do

prognóstico e tratamento mais adequado.

A imunofenotipagem dos linfomas caninos é importante para a classificação histológica e o fator prognóstico. Os

principais marcadores para a imunofenotipagem dos linfomas caninos e felinos, resistentes à fixação por formalina, são o

CD20, o CD79A e o Pax5, para os linfomas de células B (Figuras 9.11 e 9.12), e CD3 para os linfomas de células T

(Figura 9.13). Atualmente, não há um marcador de linhagem específica para células NK em cães e gatos, sendo utilizado

para o auxílio da imunofenotipagem desses linfomas (de células NK) o anticorpo Granzima B.

Figura 9.6 Canino. Rabdomiossarcoma metastático. Positividade citoplasmática esparsa nas células neoplásicas para

desmina. Imuno­histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.

Figura 9.7 Canino. Fêmur hemangiossarcoma ósseo. A. Corte histológico corado por HE, onde se observam células

fusiformes neoplásicas e grande quantidade de eritrócitos. B. Células fusiformes neoplásicas positivas para vimentina. C.

Células fusiformes neoplásicas positivas para fator VIII. Imuno­histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina.

Imagem cedida por VetMol.

Figura 9.8 Canino. Pele, subcutâneo, tumor maligno de bainha neural periférica. A. Positividade membranosa e

citoplasmática para CD56. B. Positividade citoplasmática para GFAP. Imuno­histoquímica, polímero, DAB, contracoloração

hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.

Figura 9.9 Canino. Melanoma acral. A. Imunorreatividade positiva para PNL2. B. Imunorreatividade positiva para Melan A.

C. Imunorreatividade positiva para S100. Imuno­histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem

cedida por VetMol.

Como marcadores para os plasmocitomas caninos, são utilizados o MUM­1 (expresso em 90% dos plasmocitomas), o

CD20 e o CD79A com padrões de positividades variáveis (Figura 9.14).

A proliferação de mastócitos está associada à mutação do proto­ocogene c­KIT, que é responsável pela produção de uma

proteína KIT (CD117), que estimula a proliferação dessas células. Essa proteína também é conhecida como fator de

crescimento dos mastócitos.

Um grupo de pesquisadores

7,8

realizou estudos correlacionando o padrão de imunocoloração da proteína KIT nos

mastocitomas cutâneos e subcutâneos com o comportamento biológico desses tumores nos cães. Foram determinados três

padrões da proteína KIT (CD117) nos mastócitos neoplásicos, padrão KIT 1 (imunocoloração membranosa; Figura 9.15

A), padrão KIT 2 (citoplasmática focal perinuclear associada à perda de marcação membranosa; Figura 9.15 B) e padrão

KIT 3 (marcação citoplasmática difusa; Figura 9.15 C). Os padrões 2 e 3 da proteína KIT estão associados ao aumento do

risco de recidiva tumoral e/ou à metástase. Os mastocitomas cutâneos e subcutâneos caninos com padrão KIT1, na maioria

dos casos, não estão associados a prognóstico ruim.

■

Associado à análise da proteína KIT, o Ki67 (clone MIB­1) também tem valor prognóstico nos mastocitomas cutâneos e

subcutâneos caninos (Figura 9.16). A metodologia de contagem de células positivas para o Ki67 foi descrita por Webster et

al.

7 e é altamente reprodutível na rotina diagnóstica. Nesta metodologia, com o auxílio de um retículo de 1­cm

2 10 × 10 em

objetiva de 40, são contados os núcleos positivos para o Ki67. Quando no campo de um retículo houver mais de 23 células

positivas para Ki67 em mastocitomas cutâneos e 22 células positivas nos mastocitomas subcutâneos, a chance de

recorrência local e metástase será maior. Quando estes números não somarem em um único retículo, será avaliado o

resultado da média de 5 campos (40 ×) em uma área de maior proliferação celular no infiltrado tumoral.

Nos felinos, até o momento da publicação deste capítulo, não havia um consenso entre os estudos do valor prognóstico

dos marcadores KIT (CD117) e Ki67.

Figura 9.10 Canino. Melanoma acral amelanótico. Presença de células fusiformes com nucléolos evidentes e ausência de

pigmento de melanina (HE). Células neoplásicas positivas para Melan A. Imuno­histoquímica, polímero, DAB,

contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.

Marcadores

O diagnóstico imuno­histoquímico das doenças histiocíticas nos cães e gatos é complicado, pois vários marcadores

amplamente utilizados na medicina humana não apresentam reação cruzada com o tecido dessas espécies. Ainda, muitos

marcadores linhagem­específicos somente funcionam em cortes de congelação. A seguir, serão descritos os principais

marcadores para as doenças histiocíticas neoplásicas em cães e gatos que funcionam em tecido fixado em formol e incluído

em parafina.

• Marcadores para o histiocitoma (Figura 9.17) e a histiocitose cutânea de células de Langerhans: CD18 (+), MHC II (+),

lisozima (+), E­caderina (±). Essas neoplasias não expressam CD204, CD163, Thy­1 (CD90), CD45RA e CD3, sendo

estes marcadores úteis na construção de painéis diagnósticos para a diferenciação de sarcoma histiocítico, histiocitose

reativa e linfomas cutâneos de células T

• Marcadores para o sarcoma histiocítico de células dendríticas: MHC II (+), CD18 (+), lisozima (+), CD204 (±), CD163

(–). A molécula de superfície CD204, apesar de ser um receptor macrofágico, assim como o CD163 (Figura 9.18),

apresentou positividade em uma série de sarcomas histiocíticos de células dendríticas em estudo recente

9

• Marcadores para o sarcoma histiocítico de origem macrofágica: CD18 (+), MHC II (+), lisozima (+), CD204 (+),

CD163 (±)

• Sarcoma histiocítico eritrofagocitário: CD11 d (+), CD18 (+), MHC II (+), lisozima (+), CD204 (±), CD163 (±)

• Histiocitose felina progressiva: CD18 (+), MHC II (+), lisozima (+), E­caderina (±)

• Histiocitose pulmonar de células de Langerhans: CD18 (+), MHC II (+), lisozima (+), E­caderina (+) (Figura 9.19).

Em sítios extrapulmonares, o marcador E­caderina pode ser negativo.

Não há marcadores específicos para o tumor venéreo transmissível (TVT), no entanto eles expressam consistentemente

CD45RA, lisozima e MCH II (Figura 9.20) e são negativos para os marcadores de linhagem celular T e B.

Em relação aos tumores de mama em cadelas, a reação de imuno­histoquímica pode ser realizada para fins prognósticos.

Gama et al.

10

relataram quatro tipos de fenótipos moleculares dos tumores de mama em caninos, com base na classificação

humana. Foram utilizados cinco anticorpos diferentes (receptor de progesterona­RP; receptor de estrógeno alfa­RE, HER2; p63; citoqueratina 5 e caderinas). Os tumores com piores prognósticos, relacionados com menor sobrevida e tempo livre

da doença, foram os basais RE (–), HER2 (–) e p63 (+). Esse painel não é feito de rotina na Medicina Veterinária, mas

bem­aceito e utilizado na Medicina Humana.

Figura 9.11 Felino. A. Intestino, linfoma de células T, células linfoides neoplásicas com poucas atipias, HE. B. Positividade

para o anticorpo CD3. Imuno­histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.

Figura 9.12 Canino. Linfoma de células B. A. Baço. Positividade nuclear para Pax5. B. Linfonodo. Positividade

membranosa para o anticorpo CD20. Imuno­histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida

por VetMol.

Figura 9.13 Canino. Pele, linfoma cutâneo epiteliotrópico. A. Nota­se a intensa infiltração de células linfoides T CD3

positivas no epitélio folicular. B. Nota­se a infiltração de células linfoides T CD3 positivas na epiderme com formação de

microabscesso de Pautrier (*). Imuno­histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por

VetMol.

Figura 9.14 Canino. Massa cutânea com diagnóstico de neoplasia maligna de célula redonda indiferenciada. Painel imunohistoquímico para plasmocitoma. A. Observa­se infiltrado neoplásico composto de células arredondadas, HE. B. Células

neoplásicas positivas para MUM1 (marcador de plasmócitos). C. Células neoplásicas positivas para CD79A (marcador de

células linfoides B e persistente em alguns plasmócitos). D. Células neoplásicas positivas para CD20 (marcador de células

linfoides B, persistentes em alguns plasmócitos). E. Células neoplásicas negativas para CD3, com raros linfócitos T reativos

infiltrando a neoplasia. Imuno­histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.

Figura 9.15 Mastocitoma cutâneo canino, positividade para CD117 (c­KIT ou proteína KIT). A. Padrão de marcação KIT 1

(membranoso). B. Padrão de marcação KIT 2 (citoplasmática focal perinuclear associada à perda de marcação

membranosa). C. Padrão de marcação KIT 3 (citoplasmático difuso), de acordo com Webster et al.

7

Imuno­histoquímica,

polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.

Figura 9.16 Mastocitoma cutâneo canino. Avaliação da taxa de proliferação celular com o anticorpo primário Ki67 (clone

MIB­1). A. Mastocitoma de baixo grau de malignidade/grau II de Patnaik. Positividade nuclear para Ki67. Baixa proliferação

celular com menos de 23 células positivas, avaliadas em 5 campos (objetiva de 40 ×) com auxílio de retículo de 10 × 10

mm (1­cm2

). B. Mastocitoma de baixo grau de malignidade/grau II de Patnaik, positividade nuclear para Ki67. Alta

proliferação celular com mais de 23 células positivas, avaliadas em um único campo (objetiva de 40 ×) com auxílio de

retículo de 10 × 10 mm (1­cm2

). Contagem feita de acordo com Webster et al.

7

Imagem cedida por VetMol.

Figura 9.17 Canino. Pele, histiocitoma. A. Positividade membranosa e citoplasmática para o MHC II nas células

neoplásicas. B. Positividade membranosa em queratinócitos da epiderme e nas células neoplásicas para E­caderina.

Imuno­histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.

Peña et al.

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sugerem que o painel imuno­histoquímico para tumores de mama incluam marcadores para células

mioepiteliais (p63 e/ou calponina); para células luminais (citoquerainas 8, 18 e 19); RE, RP e HER­2. No último consenso

nacional sobre tumores de mama em cadelas (Belo Horizonte, dezembro de 2013), recomendou­se um painel prognóstico

com o uso de anticorpos para RE, RP, COX­2, E­caderina e Ki67 (Figura 9.21). A pesquisa de metástases de carcinomas

mamários em linfonodos também pode ser feita com auxílio da pancitoqueratina (AE1AE3), que evidencia focos de

micrometástase.

Os tumores neuroendócrinos (NET, do inglês neuroendocrine tumors) são neoplasias de difícil diagnóstico

anatomopatológico, e o auxílio do exame imuno­histoquímico é sempre recomendado. Os marcadores primários de todos

os NET são a cromogranina, o CD56 e a sinaptofisina.

Figura 9.18 Canino. Pele, sarcoma histiocítico, positividade citoplasmática granular de CD163 nas células neoplásicas.

Imuno­histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.

Os NET são um grupo de neoplasias malignas sólidas, com origem a partir de células neuroendócrinas encontradas em

todo o corpo. Alguns NET, denominados NET funcionais, podem produzir sintomas e comorbidades relacionadas com a

secreção de hormônios ou peptídios específicos (p. ex., diarreia, hipoglicemia). No entanto, muitos NET são chamados não

funcionais, porque eles são clinicamente silenciosos (assintomáticos) ou apenas produzem sintomas causados pela presença

da massa tumoral (p. ex., dor, obstrução, sangramento). Em cães e gatos, os NET são raros e, geralmente, multihormonais, isto é, têm o envolvimento de vários hormônios secretados pelo tumor. Os NET podem ser designados por

meio de uma variedade de termos, como “carcinoides”, “tumores carcinoides”, “tumores endócrinos”, ou tumores

neuroendócrinos gastrenteropancreáticos (GEP­NET). A Tabela 9.5 apresenta os vários tipos de marcadores para os NET.

Figura 9.19 Felino, nódulo pulmonar. Histiocitose pulmonar de células de Langerhans, positividade difusa para E­caderina

nas células histiocíticas. Imuno­histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.

Figura 9.20 Canino. Linfonodo, metástase de tumor venéreo transmissível. A. Marcação citoplasmática granular para

lisozima das células neoplásicas. B. Positividade membranosa para CD45RA das células neoplásicas. C. Positividade para

MHC II das células neoplásicas. Imuno­histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por

VetMol.

Figura 9.21 Canino, tumor de mama. A. Positividade membranosa nas células neoplásicas para E­caderina. B.

Positividade nuclear nas células neoplásicas para receptor de progesterona. C. Positividade citoplasmática nas células

neoplásicas para ciclo­oxigenase 2. Imuno­histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por

VetMol.

Considerações finais

Nos últimos anos, o uso da técnica de imuno­histoquímica cresceu bastante na rotina diagnóstica oncológica veterinária.

Deve­se lembrar que esta é uma técnica viável, que é feita no mesmo material que foi utilizado para o diagnóstico

histopatológico da neoplasia (o mesmo bloco de parafina) e que auxilia no diagnóstico morfológico, na determinação de

fatores prognósticos e preditivos, importantes na tomada de decisão da conduta com o paciente oncológico.

Tabela 9.5 Vários tipos de tumor neuroendócrino e seus marcadores imuno­histoquímicos.

Tipos Sítio primário Hormônio predominantemente

envolvido

MarcadoresIHQ

Carcinoide Estômago, intestinodelgadogrosso,

pâncreas

Serotonina CK (+), marcadoresprimários,

serotonina +

Gastrinoma Duodeno,pâncreas Gastrina Gastrina(+),polipeptídiopancreático

(±)

Insulinoma Pâncreas Insulina Insulina(+),50%multi-hormonal

(polipeptídiopancreático,gastrina,

glucagon, somatostatina, ACTH)

VIPoma Pâncreas Peptídiointestinalvasoativo Peptídiointestinalvasoativo(+)

Glucagonoma Pâncreas Glucagon Glucagon (+),polipeptídio

pancreático(±), insulina(±)

Somatostatinoma Pâncreas,duodeno Somatostatina Somatostatina +,polipeptídio

pancreático ±,gastrina(±), ACTH (±),

calcitonina(±)

ACTHoma Adrenal,pâncreas ACTH ACTH (+)

GRFoma Pâncreas, hipotálamo GRF GRF(+)

ACTH = hormônioadrenocorticotró쬡co; GRF = fatordeliberaçãodo hormôniodecrescimento.

Referências bibliográficas

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