2

Em felinos, os tumores de glândulas apócrinas, de ductos biliares, os carcinomas bronquioloalveolares, adenocarcinomas

intestinais, meningiomas, tumores de tireoide, hemangiopericitomas, linfomas de células T e hemangiossarcomas

apresentaram expressão da gp­P. Em contraste, os tumores de célula basal, os fibrossarcomas, o sarcoma histiocítico, o

carcinoma hepatocelular e o carcinoma de células de transição não apresentaram expressão.

1

Proteína associada à resistência a múltiplas drogas

Em 1992, Cole et al. descobriram um segundo tipo de proteína que atua como uma bomba de efluxo de fármacos em uma

linhagem celular isolada de carcinoma de pequenas células de pulmão resistentes à doxorrubicina (HL60/Adr).

3 Essa

proteína, denominada proteína associada à resistência a múltiplas drogas (MRP), é o segundo mecanismo mais frequente

de RMD e pode ser responsável por esse fenômeno nos casos em que a gp­P não está envolvida.

Assim como a gp­P, a MRP pertence à superfamília dos transportadores ABC (ABCC). A subfamília MRP é composta

de 30 membros, e nove destes estão primariamente envolvidos na RMD. A MRP1 (ABCC1) e a MRP2 (ABCC2) são os

membros mais bem caracterizados.

A MRP1 é expressa em vários tecidos humanos, incluindo pulmões, testículos, rins, músculos cardíaco e esquelético,

placenta e macrófagos. Ela também tem sido localizada predominantemente nas barreiras hematoteciduais, como na

membrana basolateral do plexo coroide da barreira hematencefálica, no epitélio brônquico e na membrana apical dos

sinciciotrofoblastos placentários. A MRP1 e a gp­P compartilham apenas de 15% de homologia, no entanto elas

apresentam uma sobreposição significativa no perfil de resistência. A MRP1 é capaz de conferir resistência às

antraciclinas, aos alcaloides da vinca, à epipodofilotoxina, às camptotecinas, ao metotrexato e à mitoxantrona, contudo,

diferentemente da gp­P, a MRP1 não confere resistência aos taxóis, um importante componente do perfil de resistência da

gp­P. Outra diferença entre elas é que a MRP1 atua como um transportador de substratos aniônicos lipofílicos que

transportam conjugados de glutationa, glucuronídios, sais biliares dianiônicos e conjugados de sulfato. Recentemente, a

resistência mediada pela MRP1 foi capaz de interferir na ação de fármacos inibidores de tirosinoquinase, como o imatinibe.

A expressão da MRP1 foi detectada em uma variedade de tumores humanos, como os carcinomas pulmonares,

mamários, vesical, gástrico, prostático e de tireoide. Também foram detectados em neuroblastoma, glioma, retinoblastoma,

melanoma e em blastos de pacientes com leucemia mieloide aguda. Nos carcinomas mamários, a expressão da MRP1 está

relacionada com um menor tempo até a recidiva tumoral. Além disso, foi encontrada uma correlação negativa entre a

expressão da MRP1 e a resposta ao tratamento.

Existem poucos estudos envolvendo a MRP1 em Medicina Veterinária. Sabe­se que a MRP1 canina (canMRP1)

apresenta 92% de identidade com a MRP1 humana e 88% com a MRP1 murina. A canMRP1 confere resistência ao

etoposídeo e à vincristina, entretanto falhou em conferir resistência à doxorrubicina e à mitoxantrona. Quanto a sua

distribuição nos tecidos caninos, a canMRP1 foi detectada em maiores níveis no cérebro, nos rins, no fígado e nos

testículos, enquanto nos pulmões e intestinos esses níveis foram baixos.

A MRP2 compartilha 49% de homologia com a MRP1, mas tem um padrão de expressão diferente. Enquanto a MRP1

tem uma distribuição ampla entre os tecidos, a MRP2 é principalmente expressa nas membranas na porção apical

(canicular) das membranas plasmáticas dos hepatócitos, do intestino delgado e dos túbulos proximais renais. Alguns

trabalhos demonstraram que a MRP2 é capaz de conferir resistência aos agentes antineoplásicos, como o metotrexato, a

cisplatina, o etoposídeo, a doxorrubicina, a epirrubicina, o paclitaxel, o docetaxel, a vincristina, a vimblastina e a

mitoxantrona. A expressão da MRP2 tem sido relatada em várias linhagens celulares tumorais de pulmão, estômago, rins e

colorretais.

A canMRP2 apresenta 83,4% de homologia em relação à humana e está expressa em altos níveis em rins, no fígado,

seguida por duodeno jejuno e íleo. Essa proteína não pode ser detectada no cólon, nos pulmões, no cérebro e nos testículos.

A MRP3 (ABCC3) apresenta 58% de homologia com a MRP1 e é encontrada nas glândulas adrenais, nos rins, no

intestino delgado, no colón, no pâncreas e na vesícula biliar. A sua expressão é menor nos pulmões, no baço, no estômago

e nas tonsilas. Embora tenha a maior homologia com a MRP1 entre as MRP conhecidas, a MRP3 apresenta menor

afinidade aos conjugados com a glutationa. O perfil de resistência aos fármacos inclui o metotrexato, o etoposídeo e o

teniposídeo. Em humanos, o aumento da expressão da MRP3 foi relatado em carcinomas hepatocelulares, tumores

ovarianos primários e leucemia linfoblástica aguda em adultos.

O quarto membro da superfamília MRP é a MRP4 (ABCC4). A MRP4 tem duas localizações nos tecidos normais

humanos: apical nas células dos túbulos proximais renais e no lado luminal do endotélio capilar cerebral; e nas membranas

basolaterais das células tubuloacinares prostáticas, nos hepatócitos e no epitélio do plexo coroide. A MRP4 pode

transportar para fora das células vários compostos aniônicos orgânicos com seus metabólitos, conferindo, desse modo,

resistência a vários compostos citotóxicos, e, em troca, protegendo os tecidos fundamentais contra eles. O perfil de

resistência da MRP4 inclui a 6­mercaptopurina, a 6­tioguanina, o metotrexato, o irinotecano e a topotecana.

A MRP5 (ABCC5) é amplamente distribuída em tecidos humanos, sendo encontrada em níveis mais altos no coração,

no cérebro, nos pulmões e no sistema musculoesquelético. Sua expressão nos capilares endoteliais de vários tecidos como

o coração e o cérebro tem função protetora e de barreira. O perfil de resistência é semelhante ao da MRP4, incluindo a 6­

mercaptopurina, a 6­tioguanina, a 5­fluoruracila e o metotrexato.

A MRP6 (ABCC6) apresenta 41% de semelhança estrutural com a MRP1. Contudo, a sua distribuição nos tecidos é

restrita ao fígado e aos rins. Em linhagens de células de ovário de hamster transfectadas pelo MRP6 foi demonstrado que a

proteína pode atuar como uma bomba de efluxo capaz de conferir níveis baixos de resistência ao etoposídeo e ao

teniposídeo. Além disso, estudos sugerem que a MRP6 confere níveis baixos de resistência às antraciclinas e à cisplatina.

Nos tecidos humanos, a MRP7 (ABCC10) é encontrada em níveis mais altos no pâncreas, seguido pelo fígado, pela

placenta, por pulmões, rins, cérebro, ovários, linfonodos, baço, coração, leucócitos e cólon. Semelhantemente às outras

MRP, a MRP7 também pode conferir resistência a vários fármacos antineoplásicos naturais. Um nível alto de resistência

foi observado contra o docetaxel; por sua vez, contra o paclitaxel o nível de resistência foi moderado. A MRP7 também

pode conferir resistência contra a vincristina e a vimblastina. A expressão da MRP7 em tumores humanos foi relatada em

adenocarcinoma salivar, câncer de células não pequenas pulmonares, tumores de mama, cólon, próstata, ovário e de

pâncreas.

O MRP8 (ABCC11) é um dos mais novos membros encontrados da família MRP. Ele é amplamente expresso em

tecidos humanos, com os níveis mais altos encontrados no fígado, no cérebro, na placenta, nas mamas e nos testículos. O

perfil de resistência ainda não está bem estabelecido, porém sabe­se que a MRP8 pode conferir resistência contra o 5­

fluoruracila. Clinicamente, a MRP8 é expressa em altos níveis nos tumores mamários humanos, e sua expressão foi

associada a uma menor sobrevida em pacientes com leucemias mieloides agudas.

O membro da família MRP mais recentemente clonado foi a MRP9 (ABCC12). Em humanos, ela foi encontrada no

câncer de mama, em tecido mamário normal, em testículos, no cérebro, no sistema musculoesquelético e em ovários. Ainda

não há estudos sobre o perfil de substratos da MRP9, e sua participação na resistência contra os fármacos antineoplásicos

não foi caracterizada.

Proteína de resistência ao câncer de mama

A proteína de resistência ao câncer de mama (breast cancer related protein – BCRP/ABCG2) também faz parte da

superfamília de transportadores ABC e é codificada pelo gene ABCG2. Em tecidos humanos normais, a BCRP apresenta

níveis altos na placenta, na barreira hematencefálica, em glândulas mamárias em lactação, no intestino delgado, nos rins,

nos testículos e no fígado. Os substratos da BCRP incluem o metotrexato, a mitoxantrona, a doxorrubicina, a epirrubicina,

a daunorrubicina, os inibidores de tirosinoquinase e a topotecana. A BCRP foi detectada em vários tipos de neoplasias

humanas, desde tumores hematopoéticos, como as leucemias, até tumores sólidos, tumores de cólon, esôfago, endométrio,

mama, pâncreas e pulmão. Nestes, a sua expressão foi correlacionada com evolução ruim.

Proteína relacionada com a resistência no pulmão

A proteína relacionada com a resistência no pulmão (lung resistance related protein – LRP) foi identificada em 1993, em

células tumorais de neoplasia de pulmão resistentes a múltiplas drogas, por mecanismos que não foram mediados pela gpP. Ela apresenta peso molecular de 110 kd e é a maior proteína estrutural que compõe as partículas de ribonucleoproteínas

citoplasmáticas denominadas “vaults”.

O termo “vault” foi empregado para descrever sua morfologia, que consiste em múltiplos arcos semelhantes a abóbadas

de uma catedral. “Vaults” são organelas que estão presentes no citoplasma, porém uma pequena fração está localizada na

■

membrana nuclear e nos poros nucleares. Sua função é regular o transporte de substâncias entre o núcleo e o citoplasma.

Isso sugere que a LRP possa estar envolvida no transporte de agentes citotóxicos para fora do meio intracelular.

Por meio da imuno­histoquímica, a LRP foi detectada em vários tecidos normais humanos. Uma alta expressão foi

encontrada nos epitélios dos brônquios, no trato digestivo, assim como nos queratinócitos, no córtex da adrenal e nos

macrófagos.

4 Em ratos, a LRP foi detectada no epitélio intestinal, e em coelhos, nos macrófagos alveolares. Em tecidos

fetais felinos, um estudo realizado detectou uma expressão relativamente alta da LRP, por meio de reação em cadeia pela

polimerase em tempo real (RT­PCR), em pulmão, no jejuno e no cólon. Entretanto, no coração e no cérebro a expressão foi

baixa.

5

A LRP tem sido detectada em várias linhagens de células neoplásicas e em espécimes clínicos de muitos tumores

humanos. Em um painel de linhagens celulares de neoplasias humanas extraídas de neoplasias de cólon, pulmão, rim,

mama, ovário e cérebro e também de melanomas e leucemias, a expressão da LRP foi encontrada em uma frequência de

78%. A expressão da LRP também pôde ser detectada em espécimes clínicos de pacientes humanos com leucemia mieloide

aguda, carcinoma ovariano, mieloma, fibrossarcoma, linfomas, osteossarcoma, neuroblastoma, melanoma e em neoplasias

de epitélio brônquico, ceco, cólon e reto.

Em algumas neoplasias humanas, a expressão da LRP está relacionada com a resistência a agentes alquilantes como o

melfalana. Além deste, observaram­se resistência à doxorrubicina, à vincristina, à carboplatina, à cisplatina, ao etoposídeo,

ao paclitaxel e à daunorrubicina.

Por ativação do sistema glutationa/glutationa-s-transferase

O sistema glutationa (GSH)/glutationa­S­transferase (GST) apresenta um importante papel na desintoxicação de fármacos

citotóxicos e citostáticos. A GSH é um importante antioxidante intracelular e é o tiol não proteico mais abundante presente

na célula. Ela pode interagir por meio do grupo tiol com sítios reativos de uma droga espontaneamente ou catalisada pela

GST, resultando em conjugação. O conjugado resultante é menos tóxico, mais hidrossolúvel e, portanto, mais facilmente

excretado da célula. O transporte para fora das células ocorre por meio da ação de proteínas transportadoras denominadas

GS­X (incluindo a MRP1).

Em mamíferos, as GST fazem parte da família de multigenes da fase II do metabolismo. Localizam­se preferencialmente

no citoplasma, entretanto também apresentam atividade na membrana mitocondrial, nos microssomos e no núcleo. A

expressão das GST pode variar de acordo com o sexo, a idade, a espécie, o tecido e o tipo de neoplasia. A família das GST

consiste em sete isoenzimas designadas alfa, mu, pi, theta, sigma, kappa e zeta. Entre elas, a GSTpi é a que tem sido mais

frequentemente detectada em tumores humanos e possivelmente a sua superexpressão possa resultar em um aumento na

rapidez na desintoxicação e, assim, diminuir a efetividade do tratamento.

As evidências primárias do papel da GSH/GST na resistência aos fármacos em seres humanos provêm de três fontes:

• Análise das células tumorais de pacientes antes e após o início da resistência clínica a drogas, em que se observa um

aumento da GSH/GST após o desenvolvimento da resistência

• Um aumento da GSH/GST após a seleção de linhagens celulares extraídas de tumores com resistência adquirida a

agentes antineoplásicos

• Análise da expressão de resistência após a transfecção de genes particulares da GST em linhagens celulares.

A característica comum dos substratos catalisados pela GST e conjugados com a GSH é a sua propriedade eletrofílica.

Trata­se de uma característica primária da maioria dos agentes alquilantes, e muitos estudos têm enfocado esta classe de

fármacos antineoplásicos como substratos para as GST. Em geral, as isoenzimas alfa e mu estão associadas à

desintoxicação da mostarda nitrogenada e nitrosureia, respectivamente. O aumento da expressão da isoenzima pi tem sido

associado à resistência ao melfalana, à clorambucila e à ciclofosfamida. Outros substratos para GST incluem a

doxorrubicina, a cisplatina, a mitomicina C e a vincristina.

Em humanos, muitos tumores de origem leucêmica, ovariana, mamária, pulmonar, vesical, renal, prostática, nervosa e de

cólon demonstraram aumentos na expressão de GSH/GST quando comparados com tecidos normais. Como citado

anteriormente, a GSTpi é a isoenzima mais predominantemente detectada nos espécimes tumorais e nas linhagens celulares.

Aparentemente, a GSTpi está envolvida na regulação da proliferação celular por inibir os efeitos das espécies reativas de

oxigênio (ERO) sobre a divisão celular. No caso de células neoplásicas resistentes à doxorrubicina, sugere­se que a

superexpressão da GSTpi possa influenciar no status do redox celular e suprimir a conversão da doxorrubicina em radicais

livres, semiquinona e na subsequente produção de radicais ânions superóxido e peróxido. Portanto, a superexpressão da

GSTpi também pode estar associada ao desenvolvimento da resistência aos fármacos não apenas por aumentar a

■

■

■

desintoxicação dos agentes antineoplásicos, mas também em virtude de uma supressão do ERO celular que pode induzir a

apoptose.

Por alteração do alvo da droga

As enzimas topoisomerases I e II são essenciais no funcionamento normal de qualquer célula. São elas que mantêm a

integridade do DNA, reparando­o quando danificado. Nos organismos mais simples, quando em ação reparadora, as

topoisomerases I ligam­se a uma ou duas fitas do DNA, mas introduzem um só corte em uma das fitas do DNA.

Organismos mais complexos contêm, além da topoisomerase I, a topoisomerase II, que se liga com duas fitas do DNA e

induz dois cortes durante o processo de reparação. As enzimas topos I e II têm funções recíprocas reversas, ou seja, uma é

expressa quando a outra é inibida. Ambas cortam o DNA por ataque a pontos de unidade tirosínica na ligação fosfodiéster

do DNA e são críticas para o bom funcionamento celular. Qualquer alteração no balanço entre essas enzimas é suficiente

para levar à apoptose.

As topoisomerases são alvos de importantes agentes antineoplásicos. A topoisomerase I é um alvo muito específico da

camptotecina de seus análogos, enquanto as epipodofilotoxinas, as aminoacridinas e as antraciclinas são inibidores

específicos da topoisomerase II. Os inibidores da topoisomerase estabilizam o complexo enzima­DNA após o estágio do

corte e antes de o DNA ser recomposto. Portanto, o DNA e a enzima não podem prosseguir com suas funções normais e,

consequentemente, isso leva a célula à morte.

Nas linhagens celulares selecionadas para resistência aos fármacos inibidores da topoisomerase II, a atividade ou a

qualidade dessas enzimas estão reduzidas. Mutações de ponto no gene que codifica a topoisomerase II ou deleções foram

encontradas. Provavelmente, isso seja a causa de alguns casos de resistência mediada pela topoisomerase II. Todavia, a

importância clínica desse tipo de RMD ainda não está clara. Isso se deve ao fato de muitos inibidores da topoisomerase (p.

ex., etoposídeo, doxorrubicina, daunorrubicina, entre outros) também serem substratos para a glicoproteína­P. Portanto, é

evidente que esse tipo de RMD ocasionalmente ocorra nas células em associação com outros mecanismos de resistência.

Por alterações nos mecanismos de reparação celular

A citotoxicidade da maioria dos fármacos quimioterápicos está diretamente relacionada com a habilidade de causar dano no

DNA. Existem várias respostas celulares possíveis para tais insultos potencialmente citotóxicos, incluindo indução da

apoptose, modulação da progressão do ciclo celular e tolerância ao dano e iniciação do reparo do DNA. Coletivamente,

essas respostas determinam se a célula sobreviverá, possivelmente com um genoma mutante, ou se iniciará o mecanismo

de apoptose. Respostas que promovem a sobrevivência celular têm um impacto negativo sobre a eficácia do tratamento e

levam à resistência à terapia.

Muitas drogas antineoplásicas interagem como o DNA na posição O

6 da guanina para formar adutos de DNA

extremamente potentes. A O

6

­alquilguanina­DNA alquiltransferase (O

6

­AT) é uma enzima reparadora do DNA codificada

pelo gene MGMT que tem sido recentemente associada a mecanismo de resistência aos agentes antineoplásicos. Altos

níveis de O

6

­AT foram associados à resistência à dacarbazina, à estreptozotocina e às nitrosoureias, provavelmente porque

essa enzima repara o dano no DNA induzido pela quimioterapia. Mudanças na quantidade de proteínas de reconhecimento e

reparo a lesões ao DNA (ERCC1, ERCC2 e ERCC3/XPB) foram detectadas em culturas de células com sensibilidade

alterada à cisplatina. Algumas dessas células são resistentes a vários fármacos, entretanto o número de células que exibem

resistência cruzada não é tão grande como em células com expressão de MDR/gp­P.

Por alterações de genes e proteínas envolvidas no controle da apoptose

A maioria dos agentes antineoplásicos causa direta ou indiretamente morte das células neoplásicas por meio da indução da

apoptose. Esses agentes incluem os inibidores da topoisomerase II, análogos de nucleosídios, como a citosina arabinosídio

e a fludarabina, os agentes alquilantes, a vimblastina, a vincristina e a cisplatina.

Uma célula pode entrar em apoptose ou continuar a progredir no ciclo celular após algum insulto, e isso depende da

interação de um grupo complexo de proteínas e genes que interagem para regular a progressão do ciclo celular. A

resistência aos fármacos pode surgir se as células alterarem a expressão das proteínas que regulam a propagação dos sinais

que resultam do insulto celular, como a quimioterapia, para proteger contra a apoptose. Embora muitos detalhes sobre a via

apoptótica não estejam completamente elucidados, várias proteínas são conhecidas por serem importantes reguladores desse

processo.

Proteína p53

O gene p53 codifica uma fosfoproteína com 393 aminoácidos, a qual é capaz de se ligar com sequências específicas de

DNA, atuando como um fator de transcrição. Em células normais, uma variedade de danos ao DNA, como exposição à luz

ultravioleta, radiações ionizantes e fármacos radiomiméticos, leva a um aumento da proteína p53 em decorrência da

estabilização pós­transducional. O consequente aumento da proteína p53 leva a um bloqueio do ciclo celular na fase G1,

permitindo o reparo dos danos induzidos ou espontâneos que ocorreram na fase de replicação do DNA. Caso o reparo do

DNA não seja concretizado, pode ocorrer a morte celular programada (apoptose). Assim, considera­se que o gene p53

garante a integridade genômica. Entretanto, o gene p53 não estabelece diretamente a integridade do genoma, mas atua como

um fator de transcrição para aumentar a expressão de outros genes (WAF­1, GADD45, MDM2, p21 e ciclina G). A falta de

p53 funcional em células tumorais é considerada responsável pela instabilidade genômica destas células, que se manifesta

por aneuploidias e pela habilidade de produzir amplificação gênica.

O tipo selvagem da p53 é uma fosfoproteína intranuclear de 53 kDa, que regula a transição da fase G1 para a fase S do

ciclo celular eucarioto. A p53 funciona como um transativador da transcrição genética, promovendo ou reprimindo a síntese

de mRNA. Ela representa uma garantia de manutenção da fidelidade genômica, podendo suspender o ciclo celular para

permitir que o reparo do DNA ocorra antes da nova replicação. Quando o reparo do DNA está concluído, a célula retorna à

fase G1, continuando com a replicação e a síntese do DNA.

Mutações no gene que codifica o tipo selvagem da proteína p53 têm sido observadas em uma variedade de tumores

humanos e de animais. Atualmente, é amplamente aceito que essas mutações de ponto no gene p53 ocorrem principalmente

dentro do éxon 5 a 8, causando um distúrbio na regulação normal da célula. A atividade biológica da proteína mutante p53

é alterada, o que pode causar um decréscimo ou a completa perda de sua função. Muitas formas mutantes da proteína p53

são oncogênicas e estimulam a divisão celular sem reparar as mutações de ponto do DNA durante a sua replicação.

A maioria dos agentes antineoplásicos é genotóxica, e nesse sentido a p53 tem um papel importante na resposta ao dano

do DNA induzido por fármacos quimioterápicos. A interrupção do ciclo celular na fase G1 permite o reparo do DNA antes

da fase S. Contudo, se o reparo perfeito for impossível, a p53 então aciona a morte celular programada. Nas células

tumorais com a p53 mutante, a perda da função dessa proteína e, subsequentemente, dos eventos celulares descritos

anteriormente resultam em resistência à quimioterapia. Entretanto, em algumas células, a perda do ponto de controle do G1

não influencia a quimiossensibilidade, já que o do G2 parece ser um determinante mais importante da sensibilidade. As

diferenças descritas provavelmente indicam que o tipo da resposta é um fenômeno específico do tipo celular.

Lowe et al. foram os primeiros a perceber a importância da p53 na morte celular induzida pela quimioterapia ao

detectarem que os fibroblastos embrionários de camundongos deficientes de p53 foram mais resistentes que suas

contrapartes, que conservavam esta proteína, em induzir apoptose pelos agentes quimioterápicos.

6 Estudos posteriores em

camundongos e humanos confirmaram que a p53 é um mediador crítico da morte celular induzida por muitos dos fármacos

quimioterápicos usados comumente. Grande parte dos agentes que lesam o DNA induz o acúmulo e a ativação da p53,

geralmente como resultado de modificações pós­transducionais, como a fosforilação. Clinicamente, a resposta do tumor à

quimioterapia pode ser também correlacionada com a condição da p53.

Proteínas da família BCL-2

O BCL­2 (B­cell CLL/lymphoma 2) é um oncogene que contribui para a ocorrência neoplásica em virtude da inibição da

apoptose. O BCL­2 é membro de uma grande família de genes que se divide em dois grupos principais. O primeiro grupo

consiste em proteínas antiapoptóticas que compartilham de uma alta homologia estrutural e funcional com o gene BCL­2

(Bcl­2, Bcl­XL e Mcl­1), enquanto o segundo inclui proteínas que compartilham de uma menor homologia com a BCL­2 e

exibe atividades pró­apoptóticas (Bax, Bak, Bad, Bid).

A desregulação dos membros da família BCL­2 tem sido fortemente associada à tumorigênese. Todos os homólogos

BCL­2 parecem atuar como oncoproteínas, e as proteínas pró­apoptóticas Bh3 e Bax podem agir como supressores de

tumores. A superexpressão do gene BCL­2, detectada principalmente por métodos imuno­histoquímicos, ocorre em

diferentes tipos de neoplasias humanas, incluindo as de próstata, cólon, pulmão, mama, estômago, rins, leucemias e

linfoma não Hodgkin. Em alguns desses tipos de neoplasias, sua upregulation pode ser utilizada como um marcador

prognóstico. Na maioria dos casos, a superexpressão do gene BCL­2 é associada à resistência à quimioterapia e à

radioterapia. A alta expressão da proteína Bcl­2 nas células da leucemia mieloide aguda e nos linfomas de células B indica

uma pobre resposta aos agentes quimioterápicos em relação ao desenvolvimento e ao tempo de sobrevida.

Muitos fármacos quimioterápicos foram designados para combater a progressão tumoral por meio da downregulation da

produção da proteína Bcl­2 pelas células tumorais. O ácido ocadáico e o ácido retinoico, usados no tratamento das

leucemias, provocam uma downregulation do gene BCL­2 e melhoram a resposta à quimioterapia. Entretanto, o pré­

■

tratamento da leucemia mieloide aguda com dexametasona levou à downregulation do BCL­2, ainda que sem aumentar a

sensibilização à apoptose.

A proteína Bcl­XL é outra proteína antiapoptótica que variavelmente está envolvida em neoplasias. É amplamente

expressa em neoplasias humanas, como as de cólon, pâncreas, fígado, rim, ovário, mama e linfomas. Nas células de

carcinomas mamários, a concentração excessiva da Bcl­XL e da Bcl­2 inibe a ação protetora do fator de necrose tumoral

(TNF, tumor necrosis factor).

A proteína Bax é uma supressora tumoral, o que indica que em células saudáveis sua função provoca uma morte por

apoptose de células excessivamente danificadas, contribuindo para a homeostase do tecido. Entretanto, em certas

malignidades, a concentração dessa proteína nas células neoplásicas está reduzida. Na maioria dos casos de neoplasia, as

concentrações reduzidas da Bax são acompanhadas por mutações no gene p53. Uma mutação de sentido errado no códon

273 do gene p53 pode reduzir drasticamente os níveis da Bax na célula.

Em Medicina Veterinária, a proteína Bcl­2 foi detectada por meio da técnica de imuno­histoquímica em uma linhagem

celular renal em tecidos felinos fetais, neonatais, adultos e neoplásicos. A distribuição da Bcl­2 nos tecidos sadios foi

semelhante ao observado em tecidos humanos. Nos tecidos neoplásicos estudados, a Bcl­2 foi expressa quase

uniformemente nos tumores cutâneos de células basais, nos adenomas de tireoide, nos carcinomas mamários e em 50% dos

linfomas examinados. Os autores sugerem que a Bcl­2 pode ter um papel no bloqueio da morte celular por apoptose em

uma ampla gama de tecidos felinos normais, enquanto a desregulação da Bcl­2 pode prolongar a existência ou conferir

resistência de certos tumores felinos à quimioterapia.

7

Em outro estudo, realizado pelos mesmos autores, ainda com a espécie felina, a expressão das proteínas Bax e Bcl­2 foi

avaliada em pele sadia, em 24 espécimes de tumores benignos cutâneos de células basais e em 14 espécimes de carcinomas

de células escamosas. Nesse estudo, a Bcl­2 foi detectada no epitélio basal normal e em 23 de 24 tumores de células

basais. A Bax foi detectada tanto no epitélio basal como no suprabasal, mas foi observada em apenas 7 dos 24 espécimes.

Nos espécimes que coexpressaram as duas proteínas, a proporção Bax:Bcl­2 foi 0 ou menor que 1 em 21 espécimes, 1 em

um espécime e maior que 1 em dois espécimes. Não foi detectada a expressão das duas proteínas nos espécimes de

carcinomas de células escamosas.

8

Em linfomas caninos e felinos

A quimioterapia é a principal modalidade terapêutica empregada no tratamento dos linfomas caninos e felinos. No entanto,

a resistência aos fármacos é a principal causa de falha na quimioterapia de cães e gatos com linfoma. Por esse motivo, nos

últimos anos, a maior parte dos estudos envolvendo a RMD em cães e gatos objetivou a avaliação do papel dos

mecanismos de resistência aos fármacos antineoplásicos neste neoplasma.

Os estudos que visaram a avaliar a expressão gp­P/MDR1 nos linfomas caninos no momento do diagnóstico (antes do

início do tratamento) mostraram que o nível de expressão é variável (2,7 a 93,3%) e dependeu do método de detecção e da

metodologia empregados.

9­12 Quando se comparou a frequência de marcações positivas para a gp­P no momento do

diagnóstico com o momento da recidiva tumoral ou na necropsia, constatou­se que nestes dois últimos momentos houve

um aumento considerável. Também se observou que a frequência de marcações positivas antes do início da quimioterapia

foi inversamente correlacionada com o tempo de remissão e sobrevida, enquanto a frequência de marcação positiva para gpP na recidiva foi inversamente correlacionada com o tempo da recidiva até a morte. Portanto, os pacientes com alta

frequência de imunomarcação no pré­tratamento tiveram tempos de remissão e de sobrevida significativamente menores, e

também aqueles com alta frequência de marcação para a gp­P na recidiva tiveram o tempo entre a recidiva e a morte

significativamente diminuído.

11 Adicionalmente, em outro estudo, verificou­se que a intensidade forte de marcação no

momento do diagnóstico foi considerada um fator preditivo negativo independente para sobrevida.

10

A pesquisa por associação da expressão da gp­P com outros índices clínicos associados ao prognóstico, como o sexo, o

estadiamento, a hipercalcemia, o tipo de tratamento, o envolvimento do mediastino cranial e imunofenótipo, falhou em

mostrar diferença significativa.

10 A expressão da gp­P também não pareceu ser um bom marcador de prognóstico nos casos

de linfomas indolentes.

13

O potencial papel da gp­P em causar RMD no linfoma pode ser mostrado em um estudo in vitro que utilizou uma

linhagem celular de linfoma canino de células B (GL­1). Essa linhagem celular foi submetida à exposição contínua com

doxorrubicina, a qual é conhecida por ser indutora de RMD. A partir disso, se obteviveram três sublinhagens que

mostraram forte resistência à própria doxorrubicina e ainda mais intensa à vincristina, mas não à cisplatina. Isso pode ser

explicado em razão de a cisplatina não ser transportada pela gp­P. Nas sublinhagens inicialmente resistentes à

doxorrubicina e à vincristina, houve reversão da resistência com a exposição dessas células ao verapamil, um conhecido

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inibidor da gp­P. Além disso, utilizando a técnica de western­blot, a gp­P foi detectada nas sublinhagens resistentes e

ausente na linhagem GL­1.

14

Mais recentemente, a baixa expressão do gene MDR1, determinada pela técnica de PCR em tempo real no sangue de cães

com linfoma, foi associada a efeitos adversos mais graves da quimioterapia quando comparados com os dos cães que

apresentaram a expressão mais alta do MDR1. Além disso, em análise longitudinal da expressão do gene MDR1 nesses

cães, durante o tratamento quimioterápico, concluiu­se que quatro cães que apresentaram aumento de duas ou mais vezes na

expressão do gene tiveram progressão da doença.

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Ainda são escassos os estudos envolvendo a expressão da gp­P/MDR1 em linfomas felinos. As primeiras evidências da

participação da gp­P em conferir resistência a fármacos antineoplásicos em células de linfomas felinos foram feitas

empregando linhagem celular de linfoma (FT­1) e a sublinhagem resistente à doxorrubicina (FT­1/ADM). Observou­se que

a sublinhagem FT­1/ADM foi mais resistente à vincristina que a FT­1. Além disso, o gene MDR1 e a gp­P foram

detectados na FT­1/ADM, e não na FT­1, a qual permaneceu suscetível à doxorrubicina.

16

Posteriormente, a expressão da gp­P foi avaliada em espécimes clínicos de 63 linfomas felinos, pela técnica de imunohistoquímica, no momento do diagnóstico. Além disso, buscou­se verificar a hipótese de que a maior expressão da gp­P no

momento do diagnóstico estaria associada a menores tempos de remissão e de sobrevida, no entanto isso não foi observado

nesse estudo com a técnica empregada.

17

A coexpressão de diferentes proteínas associadas a RMD foi avaliada no linfoma canino, no momento do diagnóstico,

pela técnica de imuno­histoquímica. A porcentagem de espécimes positivos para a gp­P, MRP1, GSTpi e p53 (Figura 19.2)

foram 37,5%, 25%, 56,25% e 18,75%, respectivamente. A coexpressão de quatro e três marcadores foi observada em

12,5% espécimes e de dois deles em 37,5%.

12,18

Análise quantitativa do mRNA dos genes MDR1, MRP1, LRP, ABCG2, p53, p21, Bcl­2, CD40L, GSTα e MGMT foi

realizada em cães com linfomas multicêntricos de alto grau para avaliar a associação com a resistência aos fármacos. Todos

os cães foram submetidos ao protocolo da Universidade Wisconsin­Madison modificado e divididos em dois grupos de

acordo com a resposta clínica à quimioterapia – sensível e resistente à quimioterapia. Não foi observada diferença

significativa da expressão dos genes entre os grupos. Entretanto, quatro cães do grupo resistente à quimioterapia

apresentaram aumento na expressão do gene MDR1 de 4 a 33 vezes.

Em outro estudo, observou­se que 80% e 22% dos linfomas multicêntricos caninos não tratados apresentaram expressão

da gp­P e da p53, respectivamente, pela técnica de imuno­histoquímica. Apenas a expressão da p53 foi estatisticamente

correlacionada com menor sobrevida.

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Em neoplasias mamárias caninas

A expressão da gp­P nos carcinomas mamários, detectada por meio da técnica de imuno­histoquímica, foi

significativamente maior que a observada em adenomas mamários, hiperplasia mamária e tecido mamário normal.

20

Entre os subtipos histológicos, o carcinoma tubulopapilar apresentou maior expressão da gp­P.

20,21 O aumento da

expressão da gp­P no momento do diagnóstico também pôde ser correlacionado com a recorrência tumoral após a retirada

cirúrgica e foi inversamente correlacionado com o tempo de sobrevida.

21

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Figura 19.2 Fotomicrografias de linfomas caninos submetidos à imuno­histoquímica aos anticorpos primários

antiglicoproteína­P (A), anti­MRP1 (B), antiglutationa S­transferase pi (C) e anti­p53 (D), pelo método avidina­biotinaperoxidase (ABC). Aumento: 400 ×. Marcações de coloração castanha indicam imunorreatividade positiva. Contracoloração:

hematoxilina de Harris.

Ao contrário do observado nos carcinomas mamários que superexpressam a gp­P, a superexpressão da glutationa (GSH)

foi observada nas cadelas que tiveram maior sobrevida e que não tinham metástase. In vitro, células neoplásicas extraídas

destes carcinomas mamários foram cultivadas e tratadas com doxorrubicina. As células expostas apresentaram menor

expressão do gene GSH em comparação ao grupo­controle, sem tratamento.