22

A expressão da gp­P, e também da MRP1, GSTpi e p53 (Figura 19.3), foi detectada em carcinomas mamários em 50%,

78,6%, 92,85% e 92,85% dos espécimes, respectivamente, pela técnica de imuno­histoquímica. A coexpressão dos quatro

marcadores pode ser observada em 42,85% dos espécimes estudados.

12,18 Além disso, em outro estudo, foi concluído que

as expressões da gp­P e da p53 estão correlacionadas.

21

Evidências de que mais de um mecanismo de RMD possa atuar nos carcinomas mamários também foram observadas em

um estudo que detectou a expressão dos genes MDR1 (92,2%), BCRP (100%), MRP1 (100%), MRP3 (96,1%), MRP5

(85,4%), MRP6 (64,1%) e MRP7 (97,1%) em 103 espécimes, pela RT­PCR. Mais da metade dos espécimes tumorais

(56,1%) expressou todas as proteínas transportadoras ABC avaliadas.

23

A avaliação funcional das proteínas mostrou que células transfectadas com o gene BCRP canino apresentaram 5,4 vezes

mais resistência à doxorrubicina, no entanto a sobrevivência das células na presença do metotrexato não foi afetada pela

BCRP.

23 Em outro estudo, foi constatado aumento da expressão do MDR1 nas células neoplásicas mamárias após a

exposição à vimblastina e à cisplatina. O tratamento com a cisplatina também provocou aumento da expressão da BCRP,

MRP1 e MRP3; contudo, a ciclofosfamida causou aumento somente do BCRP.

24

Em mastocitomas caninos

Nos mastocitomas, pode­se observar um número maior de espécimes positivos para a gp­P nos mastocitomas grau I do que

nos de grau III, indicando que os tumores mais bem diferenciados expressam mais frequentemente a gp­P que os tumores

indiferenciados. Esses resultados poderiam mostrar, teoricamente, que os mastocitomas grau III responderiam melhor à

quimioterapia, entretanto sabe­se que os mastocitomas grau III apresentam resposta variável à quimioterapia com uma

combinação de agentes.

25

Figura 19.3 Fotomicrografias de carcinomas mamários caninos submetidos à imuno­histoquímica aos anticorpos primários

antiglicoproteína­P (A), anti­MRP1 (B), antiglutationa S­transferase pi (C) e anti­p53 (D), pelo método avidina­biotinaperoxidase (ABC). Aumento: 400 ×. Marcações de coloração castanha indicam imunorreatividade positiva. Contracoloração:

hematoxilina de Harris.

A expressão do MDR1 e da gp­P foi avaliada por RT­PCR e western­blot, respectivamente, em três linhagens celulares

de mastocitomas provenientes da pele, da mucosa oral e gastrintestinal. A expressão do MDR1 e da gp­P foi observada

somente nas linhagens provenientes de mastocitomas na mucosa oral e gastrintestinal. A análise funcional da gp­P mostrou

que nessas mesmas linhagens houve maior acúmulo do corante rodamina 123 (substrato específico da gp­P), quando essas

foram expostas ao verapamil, um inibidor da gp­P.

26

O tratamento de mastocitomas cutâneos com prednisolona resultou em redução significativa da dimensão dos tumores

por um curto período, com a maioria dos pacientes (81%) apresentando resposta máxima com 21 dias. A expressão da gpP foi avaliada nesses pacientes antes e após o tratamento com prednisolona. A porcentagem de espécimes positivos para

gp­P foi considerada alta tanto pré (87,5%) como pós­tratamento (85,7%). Isso pode indicar que os mastocitomas já

apresentam algum grau de resistência antes do tratamento com prednisolona, no entanto este fármaco não parece interferir

na expressão da gp­P durante o tratamento.

27

Jaffe et al. verificaram que mastocitomas cutâneos caninos de grau III apresentaram uma porcentagem de células

marcadas com o p53 significativamente maior do que os tumores de graus I e II. Nestes últimos, não foram observadas

diferenças significativas entre eles, impossibilitando a distinção por essa técnica. Embora os tumores de grau III tenham

apresentado uma porcentagem significativamente maior de células marcadas, não foi possível estabelecer uma associação

entre o grau histopatológico e o tempo de sobrevivência ou o tempo de recorrência do tumor.

28

Por sua vez, Ginn et al. não conseguiram estabelecer a relação entre a expressão da p53 e o prognóstico em cães

portadores de mastocitoma cutâneo canino. Além disso, não foram verificadas diferenças significativas entre o grau

histológico do tumor e a imunorreatividade do p53. Os autores sugerem que a ausência de correlação entre a

■

imunorreatividade para p53 e o comportamento biológico do tumor decorreu da falta de especificidade do p53 para o gene

supressor mutante.

29

Um estudo encontrou que 50%, 56,25%, 93,75% e 93,75% dos mastocitomas cutâneos expressaram a gp­P, GSTpi,

MRP1 e p53, respectivamente (Figura 19.4). No entanto, a expressão dos quatro marcadores foi observada em 31,25% dos

espécimes.

18 Em outro estudo, foi possível detectar a coexpressão da MRP/gp­P em 26% dos espécimes.

25

Em osteossarcomas caninos

Mealey et al. investigaram a resistência a drogas no osteossarcoma canino, utilizando uma linhagem celular (OS2.4)

derivada de um osteossarcoma primário, histologicamente confirmado, e uma sublinhagem resistente a múltiplas drogas

(OS2.4/doxo). Nas células resistentes, foi encontrada alta expressão da gp­P, o que pode sugerir que a resistência a

múltiplas drogas induzida pela gp­P pode ser importante na falha do tratamento quimioterápico do osteossarcoma canino.

30

Posteriormente, as expressões da p53 e da gp­P foram avaliadas em espécimes clínicos de osteossarcoma canino, pela

técnica de imuno­histoquímica. Imunorreatividade para a p53 foi observada em 33% dos espécimes e para a gp­P em 18%.

Correlação positiva significativa foi encontrada entre a expressão da p53 e da gp­P. A imunomarcação dupla revelou que

em dez espécimes a expressão da p53 e da gp­P ocorreu na mesma célula neoplásica. Além disso, observou­se que a

expressão da p53 e da gp­P foi fortemente associada à sobrevida menor.

31

Inibidores da resistência a múltiplas drogas

Por mais de três décadas, pesquisas têm sido realizadas com intuito de conseguir reverter o fenômeno de RMD. Ao longo

dos anos, vários agentes foram testados, com resultados ainda com pouca aplicação clínica. Os primeiros agentes

identificados, que modulam ou inibem a função da gp­P, incluem os bloqueadores dos canais de cálcio, antagonistas da

calmodulina, agentes esteroides, inibidores da proteína C quinase, fármacos imunossupressores, antibióticos, surfactantes e

muitos outros compostos lipofílicos. Todos esses compostos são hidrofóbicos e contêm um anel aromático de baixo peso

molecular em sua molécula. Alguns desses compostos, como o verapamil, se ligam à molécula da gp­P e inibem de

maneira competitiva a ligação ou o transporte dos fármacos que são substratos da gp­P. Entretanto, esses agentes produzem

resultados insatisfatórios in vivo em virtude da interação farmacológica com os agentes quimioterápicos e a sua baixa

afinidade de ligação; e a necessidade do uso de altas doses resulta em toxicidade. Para superar essas limitações, vários

análogos novos desses primeiros moduladores foram desenvolvidos e testados com o intuito de encontrar moduladores da

gp­P com menos toxicidade e com maior potência.

Figura 19.4 Fotomicrografias de mastocitoma cutâneo canino submetido à imuno­histoquímica aos anticorpos primários

antiglicoproteína­P (A), anti­MRP1 (B), antiglutationa S­transferase pi (C) e anti­p53 (D), pelo método avidina­biotinaperoxidase (ABC). Aumento: 400 ×. Marcações de coloração castanha indicam imunorreatividade positiva. Contracoloração:

hematoxilina de Harris.

Os moduladores de gp­P de segunda geração incluem o dexverapamil (isômero D do verapamil), valspodar (PSC 833,

derivado da ciclosporina), dexniguldipina e biricodar (VX­710). Apesar de serem menos tóxicos e mais potentes, eles

também mantêm algumas características que limitam a utilidade clínica. Entre elas, a falha em reverter a RMD in vivo e a

pouca seletividade foram as mais observadas. A afinidade de alguns dos inibidores de segunda geração, como o biricodar

(VX­710), por múltiplos transportadores ABC também começou a ser vista como problemática, uma vez que mais

interações farmacológicas em potencial podem ocorrer.

Muitos fármacos antineoplásicos são substratos tanto para os transportadores ABC como para a isoenzima 3A4 do

citocromo P450. A maioria dos inibidores da gp­P de segunda geração também é substrato para o citocromo P450 (3A4) e

metabolizada por essa enzima. A competição entre os agentes antineoplásicos e os moduladores da gp­P pela atividade do

citocromo P450 (3A4) pode resultar em interações farmacológicas imprevisíveis.

Os agentes de terceira geração (elacridar, tariquidar, laniquidar, zosuquidar) foram desenvolvidos para superar as

limitações dos agentes de segunda geração. Eles não são metabolizados pelo citocromo P450 (3A4) e, portanto, não alteram

a farmacocinética plasmática dos fármacos antineoplásicos. Normalmente eles apresentam especificidade maior para a gp­P,

porém outros transportadores ABC podem ser inibidos com menor afinidade. Essa especificidade para a bomba de gp­P

reduz a possibilidade de que o bloqueio de mais de uma bomba possa resultar em uma biodisponibilidade ou excreção

alterada do agente quimioterápico.

A procura por inibidores da RMD também se estendeu aos produtos naturais. O motivo para a busca desses inibidores e

seus derivados, considerados de quarta geração, foi a expectativa de serem menos tóxicos e mais potentes que os de

primeira e segunda geração. Várias fontes de produtos naturais capazes de reverter o fenótipo de RMD têm sido

encontradas. Entre elas, as mais avaliadas foram a curcumina e os flavonoides. A curcumina e seus derivados podem inibir

a função dos três maiores transportadores ABC, gp­P, MRP e BCRP. Sua baixa biodisponibilidade quando administrados

por via oral e seu rápido metabolismo têm levado os pesquisadores a avaliar o efeito do encapsulamento da curcumina em

lipossomo. Aparentemente, a curcumina lipossomal pode reduzir o problema da biodisponibilidade quando administrada

por via intravenosa. Sua toxicidade é relativamente baixa, comparável aos inibidores de terceira geração, e tem se mostrado

efetiva em modelos animais. Os flavonoides e os isoflavonoides afetam a RMD mediada pela gp­P e MRP de forma

diferente. O mecanismo de sua ação é provavelmente a inibição da atividade da ATPase.

Recentemente, foi observado que alguns fármacos inibidores da tirosinoquinase (ITQ) também apresentam efeito

inibitório sobre a função de efluxo de fármacos dos transportadores ABC e, dessa forma, podem reverter a resistência das

células neoplásicas aos fármacos antineoplásicos tradicionais. Tal efeito pode ser evidenciado em um estudo que empregou

linhagem de células provenientes de leucemia linfoide canina, a qual foi induzida a resistência à doxorrubicina.

32 Nesse

estudo, a linhagem resistente foi menos sensível aos efeitos antiproliferativos da doxorrubicina que a linhagem original não

resistente. Embora o mesilato de masitinibe nas concentrações de 1 e 10 µM não tenha apresentado efeito adicional sobre a

citotoxicidade induzida pela doxorrubicina nas células originais, ele aumentou o efeito antiproliferativo da doxorrubicina

nas células resistentes. O mesilato de masitinibe também aumentou a concentração do corante rodamina­123, substrato

específico da gp­P nas células resistentes.

32

Alguns inibidores têm sido testados com intuito de modular os níveis de GSH e a atividade das GST nas neoplasias

humanas. O uso da BSO (butionina sulfoximina) em testes clínicos causou diminuição dos níveis de GSH na combinação

com o melfalana. A sulfassalazina também tem sido caracterizada como um modulador da atividade da GST. Um estudo in

vitro demonstrou a habilidade desse fármaco em inibir competitivamente a GSTpi e sinergicamente aumentou a

citotoxicidade da cisplatina em duas linhagens celulares de neoplasias pulmonares. O ácido etacrínico, normalmente

utilizado como um diurético, é conjugado com a GSH e também atua como um inibidor das três maiores classes de enzimas

GST. Ele aumenta a citotoxicidade de agentes alquilantes em concentrações fisiológicas apropriadas (clorambucila,

melfalana e BCNU).

As técnicas de degradação do mRNA têm sido pesquisadas como uma forma promissora de reverter a RMD. Entre elas,

a mais recente é a interferência por RNA (RNAi). A RNAi é um mecanismo celular responsável pelo silenciamento gênico

pós­transcricional que atua sobre o RNA mensageiro (mRNA). No foco deste mecanismo, está uma molécula de fita dupla

de RNA (double stranded RNA — dsRNA), que, ao ser incorporada na forma ativa a um complexo intracitoplasmático, se

liga a uma sequência de nucleotídios complementar localizada no mRNA­alvo, ocasionando assim o silenciamento, por

inibição da tradução e/ou degradação do mRNA. Essa técnica tem sido utilizada com sucesso em inibir a gp­P, MRP e

BCRP em várias linhagens celulares. Em linhagens celulares de tumores mamários caninos, a técnica mostrou ser efetiva

em silenciar os genes MDR1, BCRP, MRP1 e MRP3, o que pode ser mostrado por meio do aumento das concentrações

intracelulares do corante rodamina­123 e da diminuição da atividade de bomba de efluxo.

24

Considerações finais

A quimioterapia é a principal modalidade terapêutica de determinadas neoplasias, como o linfoma e o TVT, e constitui um

importante adjuvante na terapia dos tumores sólidos, como os osteossarcomas e carcinomas mamários. Entretanto, a maior

limitação ao sucesso da quimioterapia é a resistência das células neoplásicas às drogas, que pode ocorrer tanto em tumores

constituídos por uma linhagem de células geneticamente resistentes ao quimioterápico como em neoplasias que adquirem

essa propriedade após o início do tratamento.

Entre os vários mecanismos de RMD, o que envolve a superexpressão da glicoproteína­P é o mais estudado e

caracterizado, entretanto parece estar claro que a resistência clínica à quimioterapia é multifatorial e heterogênea. A

coexpressão de diferentes proteínas relacionadas com a RMD pode ser observada em várias neoplasias em humanos e em

algumas em animais, como nos linfomas e mastocitomas. Muitos mecanismos de resistência podem atuar de modo

independente ou podem ainda estar interligados. Por exemplo, a inibição do tipo selvagem da p53 pode resultar na ativação

da gp­P, além da inter­relação anteriormente descrita da MRP com o sistema glutationa. Além disso, em humanos, a

expressão de determinados mecanismos de resistência, como a gp­P, pode variar de negativa a forte positiva, dependendo

do tecido ou do órgão que originou a neoplasia. A heterogeneidade da resistência ainda pode ser observada dentro de um

mesmo tipo tumoral. O fato de os mecanismos de resistência estarem inter­relacionados ou agindo em sinergismo, e se

apresentarem de forma heterogênea, confere uma grande complexidade ao fenômeno, o que torna mais laborioso seu

entendimento e, consequentemente, o desenvolvimento de métodos para a sua reversão.

Até o momento, estratégias de reversão dos principais mecanismos de resistência não estão disponíveis para utilização

clínica na Medicina Veterinária. Embora muitas substâncias estudadas para reversão apresentem bons resultados in vitro

empregando linhagens celulares derivadas de tumores caninos, a realização de estudos clínicos é necessária para comprovar

a efetividade nos pacientes, assim como para avaliar seus efeitos colaterais.

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