Conceitos de imunologia

O termo imunidade é derivado do latim immunitas. Historicamente, a imunidade é o meio de proteção para a doença, mais

especificamente doenças infecciosas. As células e as moléculas são responsáveis por constituírem o sistema imune, e sua

resposta coletiva ou coordenada à introdução de substâncias estranhas, os antígenos, é chamada de resposta imune.

Imunologia no câncer

O sistema imune reage aos antígenos por meio de resposta imune celular ou humoral. A imunidade tumoral, por sua vez,

ocorre predominantemente pelo processo imune celular.

7 Essa resposta pode acontecer de duas maneiras: rápida e

inespecífica ou lenta e específica. A imunidade inespecífica ou inata inclui as barreiras físicas e químicas para patógenos e

as células que fagocitam patógenos (macrófagos, células dendríticas, neutrófilos e células natural killer [NK]). Já a

imunidade específica ou adquirida é composta pelas células T e B. As células T são subdivididas em células citotóxicas,

que expressam correceptor de CD8+ e molécula de MHC classe I, e células T helper, que expressam correceptor de CD4+

e reconhecem molécula de MHC classe II.

Imunidade inespecífica

As células dendríticas (DC, dentritic cells) são células apresentadoras de antígenos (APC, antigen presenting cell) e

iniciam a resposta imune antitumor por meio de fagocitose e processando os antígenos tumorais, que ativarão as células T

específicas. Os macrófagos são as células mais eficientes para promover a fagocitose, pois reconhecem os patógenos e

■

invadem­no, levando até a apoptose das células malignas. Eles produzem produtos tóxicos, como óxido nítrico e peróxido

de hidrogênio, que têm propriedades bactericidas e tumoricidas.

8 A ativação dos macrófagos faz com que ocorra a liberação

de citocinas, como fator de necrose tumoral alfa (TNF­alfa, tumor necrosis factor alpha) e interleucinas (IL) 1, 6 e 12,

induzindo resposta inflamatória local e imune sistêmica, com subsequente ativação de neutrófilos, DC, células NK e T. Já

as células NK são responsáveis por eliminar células tumorais, especialmente aquelas que apresentam baixo MHC classe I e

escaparam da ação de células CD8+. Sua capacidade tumoricida pode ser aumentada pela presença de citocinas, incluindo

interferons e interleucinas (IL­2 e IL­12).

9 Porém, o papel das células NK na imunidade tumoral, in vivo, é incerto.

7

Imunidade específica

As células T reconhecem os peptídios (proteínas de antígenos). Já as células B reconhecem, além dos peptídios, outras

proteínas, ácidos nucleicos, lipídios e outras moléculas.

As células, na sua ativação, desempenham papel central na resposta imune. Elas apenas reconhecem as APC, sendo as

DC e os macrófagos os mais eficientes nesse processo. As APC processam os antígenos em fragmentos peptídicos que são

colocados em estruturas denominadas MHC. Assim, as células T reconhecem os antígenos por meio dos receptores

celulares [receptor de células T (TCR, T cell receptor)], sendo ativados e respondendo por meio de resposta imune celular

e humoral.

10

Células CD8+ têm papel específico nas células T citotóxicas. Quando as DC apresentadoras de antígenos do MHC

classe I coestimulam as moléculas, o antígeno específico de cada célula T CD8+ se diferencia em célula T citotóxica,

entrando no estroma tumoral.

As células T CD4+ atuam na regressão dos tumores, imprimindo a estimulação de CD8+ e transformação de CD4+ em

células T helper 1 (Th1), que produzem interferon­gama (IFN­gama) e mantêm a resposta da célula T citotóxica CD8+, ou

células T helper 2 (Th2), que produzem IL­4, IL­5 e IL­13 e suporte humoral de células B.

10

Imunovigilância do tumor

O conceito de que o sistema imune pode prevenir o câncer chama­se teoria da vigilância imunológica. A imunovigilância

propõe que o sistema imune reconheceria o aparecimento de células tumorais, eliminando­as antes da doença clinicamente

detectada. As células tumorais só cresceriam caso secretassem antígenos, mas não imunogênicos tumorais, escapando

assim da resposta imune destrutiva.

11

Mecanismos de evasão tumoral

O desenvolvimento de neoplasias em animais que apresentem seu sistema imune íntegro denota que existem vários meios

para que as células tumorais escapem ao reconhecimento do sistema imune. Quando esse processo ocorre, é chamado de

evasão tumoral, podendo surgir desde alterações da própria célula tumoral até alterações das células do sistema imune, que

não respondem à presença de células tumorais.

12 Esse processo de evasão tumoral com frequência é chamado de escape

tumoral. Muitas são as causas dessa evasão:

• A expressão de MHC classe I pode ser diminuída nas células tumorais, porque ela não é reconhecida pelas células T

citotóxicas

• Produção das células tumorais, citocinas, que suprimem a resposta imune antitumoral

• Os tumores são responsáveis pela produção de citocinas, como IL­10 e IL­6, fator de crescimento endotelial vascular

(VEGF, vascular endothelial growth factor) e fator estimulador de colônias de granulócitos­macrófagos (GM­CSF,

granulocyte­macrophage colony­stimulating factor). A circulação dessas substâncias faz com que ocorra defeito na

maturação das DC.

13,14 Antígenos tumorais podem induzir tolerância específica imunológica pelo crescimento tumoral e

ausência da ativação das DC.

Como mencionado anteriormente, as células tumorais apresentam muitos mecanismos de evasão para a resposta do

sistema imune. Porém, se descobertos esses mecanismos, é possível interferir sobre eles e bloquear a evasão tumoral.

Dessa forma, será possível tratar e garantir o sucesso da imunoterapia.

Imunoterapia

Pode­se realizar a imunoterapia dos tumores de diversas formas: ativa ou passiva, específica ou inespecífica. A

imunoterapia ativa induz uma resposta do sistema imune do animal contra o tumor. Na passiva, utiliza­se uma substância

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efetora que age diretamente contra o tumor. Na imunoterapia inespecífica, procura­se levar o sistema imune a um maior

nível de atividade, para destruir as células neoplásicas. Já a específica é dirigida contra determinados alvos tumorais, na

forma ativa (pela vacinação) ou passiva (anticorpos monoclonais).

Ativa inespecífica

Bacilo Calmette-Guérin

O bacilo Calmette­Guérin (BCG) é a utilização de Mycobacterium bovis atenuado. O mecanismo preciso do BCG

antitumoral não é muito claro; porém, em contato com as células malignas, o BCG induz a produção de citocinas, como

IFN­gama, IFN­alfa, IL­2, fazendo com que atraiam e ativem os neutrófilos, macrófagos e as células T, induzindo

memória para as células e promovendo proteção para a recidiva da doença.

15 O BCG é muito utilizado em pacientes

humanos nos carcinomas de células de transição na vesícula urinária, por meio de infusão. Segundo Meijden et al., relatase, em cães e gatos, sua aplicação intralesional, mostrando alguma resposta nas neoplasias mamárias, porém devendo estar

associada à intervenção cirúrgica. Segundo Rutten et al., o tratamento não é efetivo quando o BCG é aplicado localmente

em tumores mamários. Porém, notou­se aumento da sobrevida dos animais quando se aplicou o BCG com ou sem

Corynebacterium parvum, localmente, associado à mastectomia em cadelas.

16­19 Mukaratirwa et al. notaram que, ao se

associarem intralesional BCG e vincristina sistêmica, havia uma resposta nos TVT e também uma estimulação das células

TIL.

20

Corynebacterium parvum é uma substância bacteriana que tem atividade antitumoral em humanos e caninos com

melanoma. A utilização de C. parvum em cães com melanoma oral em estádios II e III, em associação com cirurgia,

apresentou melhores resultados do que em animais tratados apenas com cirurgia.

21,22

Lipossomo encapsulado muramil tripeptídio fosfatidiletanolamina

O lipossomo encapsulado muramil tripeptídio fosfatidiletanolamina (L­MTP­PE, liposome­encapsuled muramyl tripeptide

phosphatidyl ethanolamine) é derivado de pequena estrutura da parede do Mycobacterium. Quando o L­MTP­PE é

fagocitado, as citocinas, como IL­6 e TNF­alfa, são produzidas, estimulando os macrófagos e os monócitos a aumentarem

sua habilidade tumoricida. Sua eficácia é bem documentada na Medicina Humana em pacientes portadores de

osteossarcoma, melanoma e carcinoma renal.

23

Na Medicina Veterinária, vários trabalhos foram realizados por MacEwen et al., utilizando­se L­MTP­PE em cães e

gatos com vários tipos de neoplasias.

22,24,25 Realizaram­se amputações nos cães que apresentavam osteossarcomas

apendiculares, administrando­se L­MTP­PE (IV) em 50% dos casos; os demais receberam placebo. O tempo de sobrevida

foi de 7,4 meses para os animais tratados com L­MTP­PE e 3 meses para os demais.

23

Já em outro estudo, compararam­se

cães com osteossarcoma apendicular a animais que recebiam quimioterapia, com cisplatina associada a L­MTP­PE, ou

apenas cisplatina, notando­se também maior tempo de sobrevida nos animais que receberam associação de medicamentos

(14,6 meses vs. 10 meses).

26

Vail et al. utilizaram L­MTP­PE em cães com hemangiossarcoma esplênico. Os animais eram esplenectomizados,

formando­se dois grupos: um recebia quimioterapia (doxorrubicina mais ciclofosfamida) associada a L­MTP­PE, e o outro

o mesmo protocolo quimioterápico, porém apenas lipossomo placebo (L­PE) — evidenciou­se sobrevida com 9 meses

versus 5,7 meses nos cães que receberam L­MTP­PE.

27

MacEwen et al., em estudo randomizado, utilizaram L­MTP­PE associado ao recombinante canino do fator estimulador

de colônias de granulócitos e macrófagos (rcGM­CSF, recombinant canine granulocyte­macrophage colony­stimulating

factor) em 98 cães com melanoma oral em estádios II e III.

25 Compararam­se os cães apenas operados (controle) àqueles

animais operados que receberam L­MTP­PE associado a GM­CSF ou apenas L­MTP­PE. Notou­se que não ocorreu

diferença significativa nos animais que receberam tratamento no grupo­controle. Porém, os cães que iniciaram o tratamento

mais precocemente (estádio I) apresentaram maior sobrevida, livre da doença.

Celular inespecífica

Interleucina-2

A IL­2 foi descoberta como fator de crescimento para células T. Os linfócitos humanos cultivados na presença de altas

doses de IL­2 têm grande atividade citotóxica contra as células tumorais, sendo denominados lymphokina­actived killers

(LAK). São capazes de manter remissão durável de 25 a 30% em pacientes com metástases de melanoma e carcinoma

renal.

28 Na medicina veterinária, o tratamento com IL­2 humana indica que os receptores da IL­2 canina respondem à

estimulação da interleucina humana.

29 Os cães que receberam IL­2 por via intravenosa (IV) em altas doses, durante 4 dias,

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■

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quando receberam aplicação de linfócitos humanos, apresentaram apenas sintomatologia gastrintestinal, não se observando

febre, edema e choque.

30

Passiva

Refere­se à terapia na qual se utiliza o agente ou a célula administrada para resposta terapêutica, tradicionalmente

caracterizada pelas terapias de anticorpos.

Anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais (mAc) vêm sendo estudados há mais de 30 anos. Sua obtenção foi possível pela formação de

hibridomas, ou seja, a fusão de células B normais obtidas de pessoas que haviam sido imunizadas com determinado

antígeno, secretando­se assim anticorpos contra esse antígeno, com plasmócitos neoplásicos incapazes de secretar as

imunoglobulinas.

31

A terapia mAc vem sendo aplicada em vários estudos clínicos e como rotina em pacientes humanos com câncer. Segundo

Slamon et al., a utilização de trastuzumabe para câncer de mama deve ser associada à quimioterapia, a fim de se obter

maior sucesso.

32

Ativa específica

Vacinas antitumorais

As vacinas para câncer são a forma mais ativa de imunoterapia, uma vez que agem sobre o sistema imune e são específicas

para aquele tumor. Existem várias formas de vacinas antitumorais com células ou lisados tumorais, peptídios derivados de

antígenos tumorais. Podem utilizar modificações genéticas nas células tumorais que as levem a expressar moléculas de

membrana que estimulam as células T ou secretem citocinas.

O alvo do tratamento com vacinas anticâncer é induzir a resposta imune antitumoral, levando à regressão tumoral ou das

metástases. Diferentemente da resposta da quimioterapia, a qual resulta na rápida morte celular, a resposta clínica das

vacinas depende do sistema imune, levando­se, às vezes, vários meses para se obter resposta, a qual poderá ser célulamediada ou resposta humoral.

Estão sendo desenvolvidos vários estudos clínicos de vacinas antitumorais, de diversos tipos, em vários ensaios em

fases I a III.

Tipos de vacinas

Vacinas de conjunto de células e lisados tumorais

São vacinas feitas com o próprio tecido, ou melhor, do tumor do paciente (vacinas autólogas), preparadas individualmente

para cada paciente. Quando se utilizam as vacinas de um conjunto de células, significa que são várias células do mesmo

tipo histológico do tumor, porém de vários pacientes, pool de células tumorais. Essas células, para serem inativadas, ou

melhor, mortas, são irradiadas com raios gama. Muitas vezes são adicionados e/ou introduzidos ativadores antes ou logo

após a inativação das células.

Elas podem proteger de forma heterogênea contra os antígenos, impossibilitando a ocorrência da evasão tumoral em

vários tipos de câncer.

U’ren et al. investigaram o papel terapêutico de vacinas alogênicas de células lisadas tumorais em trabalho não

randomizado, em fases I e II, em animais com hemangiossarcoma e melanoma.

33 Os animais recebiam a vacina a cada 2

semanas, durante 3 meses, mantendo a quimioterapia em conjunto com a vacina. A toxicidade foi mínima. Apenas 6 de 75

cães apresentaram vômitos, náuseas, febre e leve dor abdominal. Eles notaram que o tempo de sobrevida foi maior nos

pacientes que haviam recebido a vacina.

Podem­se utilizar diferentes adjuvantes nas vacinas de células ou lisados tumorais, já que vários são os caminhos para

imunoestimular o paciente ao tumor. As citocinas, como IL­2, IL­12, GM­CSF e IL­15, são as mais usadas.

Segundo Hooge et al., quando utilizaram vacinas autólogas com conjunto de células lisadas, tranfectadas com GM­CSF

em sarcomas de tecidos moles e melanoma, notou­se, no local da vacina, grande infiltrado de células inflamatórias,

diferentemente dos animais que só receberam vacina placebo.

34

Em estudo desenvolvido por Alexander et al., no qual se utilizavam vacinas feitas por um conjunto de células alogênicas

expressando o antígeno gp100 (xenogênico), conseguiu­se manter resposta parcial em cinco casos e total em apenas um

caso de melanoma entre 34 animais tratados, mantendo­se essa resposta por mais de 6 semanas no mínimo.

35

■

Felizzola, em um estudo com 35 animais usando vacinas autólogas feitas com o próprio tumor, em cães com melanoma

oral, comparou pacientes operados que receberam quimioterapia e operados com imunoterapia e puderam concluir que os

pacientes que receberam a vacina após terem sido operados apresentaram, em 1 ano, sobrevida de 50% (Figuras 22.1 e

22.2).

36 Foram desenvolvidas vacinas heterólogas, pelo mesmo autor, para cães submetidos à cirurgia e sem a coleta no ato

cirúrgico. Utilizaram outros melanomas de cães, nos quais foram realizados um pool de tumores e aplicados em outro

animal (Figuras 22.3 e 22.4).

37

Figura 22.1 Sobrevida das vacinas autólogas de melanoma para cães.

Figura 22.2 Vacinas autólogas para cães com melanoma.

Em um relato de caso que apresentava neoplasia pulmonar (adenocarcinoma bronquiolar) associaram cirurgia e aplicação

de lisado de células tumorais, que apresenta de 6 a 27 dias de sobrevida pós­operatório. Com a aplicação desta vacina na

30

a

semana, foi feito BCG. O paciente, então, sobreviveu livre de doença e metástases até a 44

a

semana e foi eutanaziado

na 50

a

semana.

38

Vacinas genéticas

São vacinas que apresentam modificações genéticas de células tumorais que as levam a expressar moléculas de membrana

coestimulatória para células T ou mesmo a secretar citocinas. Nas vacinas gênicas, utilizam­se vetores de plasmídio de

ácido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid) que induzem a resposta imunológica celular e humoral do paciente

■

contra o alvo do tumor. As vacinas são aplicadas via intradérmica ou no músculo para ativar localmente as DC. Esses

vetores são imunologicamente inertes.

Figura 22.3 Gráfico de sobrevida das vacinas heterólogas de melanoma para cães (Kaplan Meier).

Figura 22.4 Vacinas de um pool de cães com melanoma, isto é, células heterólogas.

Desde 1990, essas vacinas vêm sendo utilizadas em pacientes humanos com melanoma cutâneo metastático, linfoma,

câncer de próstata e carcinoma renal com até 20% de regressão tumoral.

Em grande estudo efetuado na medicina veterinária, foram utilizadas vacinas xenogênicas com DNA humano ligado a

uma proteína tirosinase, as quais foram usadas em cães com melanoma oral. Os cães receberam a vacina após o tratamento

local da doença por meio de cirurgia. Após receberem a vacina 2 vezes/semana por 4 semanas, notou­se que os cães

apresentaram grande aumento na sobrevida em comparação apenas ao tratamento convencional.

38

Existem vacinas que apresentam mais de um método para obtenção, isto é, utilizam a terapia gênica associada ao

conjunto de células lisadas, como a vacina feita para melanoma canino com a proteína g100.

34

Vacinas vetores virais

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12.

Utilizam­se os vetores virais em vacinas para poder expressar genes. Nas vacinas antitumorais com vetores virais, elas

ajudaram a carrear genes com antígenos, imunoestimuladores de citocinas e moléculas para dentro da célula tumoral,

promovendo, assim, resposta do paciente ante o câncer. Os vírus utilizados são atenuados, não causando efeitos patógenos

ao paciente com câncer. A família Poxviridae é a mais utilizada como DNA viral, para imunoestimular o paciente com

câncer.

39

Vacinas de células dendríticas

As DC são os mais potentes antígenos presentes nas células, tendo papel fundamental na resposta imune primária.

40

Vacinas com DC em humanos vêm demonstrando baixa toxicidade quando comparadas a quimioterapia e imunoterapia

com IL­2 e IFN­alfa, sendo a resposta mais específica contra a célula tumoral, levando ganho à qualidade de vida. As DC

podem ser pulsadas ou incluídas com peptídios tumorais, ácido ribonucleico (RNA, ribonucleic acid) ou DNA em

antígenos tumorais conhecidos ou com células tumorais lisadas, com vetores virais ou não (lipossomos). A preparação das

vacinas de DC necessita de intenso processo laboratorial e longo período para sua manipulação.

40

As DC poderão ser originadas in vitro de células sanguíneas mononucleares periféricas ou da medula óssea, coletadas de

um animal saudável. São utilizadas citocinas (GM­CSF, TNF) para promover a diferenciação das células sanguíneas em

DC, nas culturas de células em estufa.

41,42 Elas permanecem durante 7 a 10 dias, quando já ocorre sua diferenciação, e

haverá as DC. Logo após a obtenção dessas células DC, dependendo do tipo de vacina, elas serão pulsadas com extratos de

linhagens tumorais ou transformadas com RNA tumoral do paciente, utilizando vetores virais.

Gyorffy et al. enfatizam a eficácia das vacinas com DC em cães com melanoma oral. As vacinas são aplicadas

mensalmente, em um total de três aplicações. Anteriormente, os cães eram tratados com métodos conservadores (cirurgia e

radioterapia), encontrando­se um longo tempo sem recidiva.

43

Considerações finais

Nota­se que as vacinas antitumorais agem como coadjuvantes no tratamento do câncer primário, bem como em metástases,

estabilizando a doença e melhorando a qualidade de vida. Essas vacinas não têm os efeitos tóxicos da quimioterapia,

levando a uma melhor aceitação por veterinários e proprietários. O futuro da Oncologia será o tratamento celular e o

tratamento com vacinas antitumorais; contudo, enquanto isso, ainda devem ser realizados mais estudos e pesquisas em

busca de novas descobertas nessa área. Sabendo que o cão é o modelo experimental do homem em comportamento de

tumores espontâneo, estudos na Veterinária ajudarão o tratamento de câncer nos homens.

Referências bibliográficas

FERREIRA, C. G.; ROCHA, J. C. Oncologia Molecular, São Paulo: Atheneu, p. 469, 2004.

BILLER, B. J.; DOW, S. Immunotherapy of cancer. In: WITHROW, S. J.; VAIL, D. M. Small Animal Clinical Oncology. 4. ed. St.

Louis: Elsevier, p. 211­235, 2007.

KNAAP, D. W. Immunotherapy and biologic response modifiers. In: MORRISON, W. B. Cancer in Dogs and Cats. Medical and

Surgical Management. Baltimore: Willians & Wikins, p. 453­468, 1998.

PANDOLI, D. Cancer vaccines. Nat. Med., v. 4, p. 225, 1998.

SCHATZMAYR, H. G. New perspectives in viral vaccines. Hist. Cienc. Saúde Manguinhos, v. 10, p. 655­69, 2003.

CAO, X.; ZHANG, W; WANG, J. et al. Therapy of established tumor with a hybrid cellular vaccine generated by using granulocytemacrophage colony­stimulating factor genetically modified dendritic cells. Immunol., v. 97, p. 616­625, 1999.

ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H. General proprieties of immune response. In: ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; POBER, J. S.

Cellular and Molecular Immunology. 5. ed. Philadelphia: WB Saunders, p. 3­15, 2000.

STUEHR, D. J.; NATHAN, C. F. Nitric oxide. A macrofage product responsible for cytostasis and respiratory inhibition in tumor

target cells. J. Exp. Med., v. 169, p. 1543­1555, 1989.

CROWE, N. Y.; SMYTH, M. J.; GODFREY, D. I. A critical role for natural killer T cells T cells in immunosurveillance and

immunotherapy. Nat. Immunol., v. 2, p. 293­2, 2002.

VIOLA, J. P. B.; TEIXEIRA, L. K.; WERNECK, M. B. Imunologia tumoral. In: FERREIRA, C. G.; ROCHA, J. C. Oncologia

Molecular. São Paulo: Atheneu, cap. 10, 2004.

BURNET, F. M. The concept of immunological surveillance. Prog. Exp. Tumor Res., v. 13, p. 1­27, 1970.

BARBUTO, J. A. M. Imunoterapias e vacinas. In: FERREIRA, C. G.; ROCHA, J. C. Oncologia Molecular. São Paulo: Atheneu, p.

427­435, 2004.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

37.

38.

BOTELLA­ESTRADA, R.; DASI, F.; RAMOS, D. et al. Cytokine expression and dendritic cell density in melanoma sentinel

nodes. Melanoma Res., v. 15, p. 99­106, 2005.

CATCHOLE, B.; GOULD, S. M.; KELLETT­GREGORY, L. M. et al. Immunosupressive cytokines in the regional lymph node of a

dog suffering from oral malignant melanoma. J. Small Anim. Pract., v. 43, p. 464­467, 2002.

LUO,Y.;YAMADA, H.; CHEN, X. et al. Recombinant Mycobacterium bovis bacillus Calmette­Guerin (BCG) expressing mouse

IL­18 augments TH2 immunity and macrophage cytotoxicity. Clin. Exp. Immunol., v. 137, p. 24­34, 2004.

VAN DER MEIJDEN, A. P.; STEERENBERG, P. A.; DE JONG, W. H. et al. The effects of intravesical and intradermal

application of a new BCG on the dog bladder. Urol. Res., v. 14, p. 207­210, 1986.

RUTTEN, V. P.; MISDORP, W.; GAUTHIER, A. et al. Immunological aspects of mammary tumors in dogs and cats: a survey

including own studies and pertinent literature. Vet. Immunol. Immunopathol., v. 26, p. 211­225, 1990.

KLEIN, W. R.; RUTTEN, V. P.; STEERENBERG, P. A. et al. The present status of BCG treatment in the veterinary practice. In

Vivo, v. 5, p. 605­608, 1991.

PARODI, A. L.; MISDORP, W.; MIALOT, J. P. et al. Intratumoral BCG and Corynebacterium parvum therapy of canine mammary

tumours before radical mastectomy. Cancer Immunol. Immunother., v. 15, p. 172­177, 1983.

MUKARATIRWA S.; CHITANGA t.; CHIMATIRA T. et al. Combination therapy using intratumoral bacillus Calmette­Guerin

(BCG) and vincristine in dogs with transmissible venereal tumours: therapeutic efficacy and histological changes. J. S. Afric. Vet.

Assoc., v. 80, p. 92­96, 2009.

LIPTON, A.; HARVEY, H. A.; BALCH, C. M. et al. Coryne­bacterium parvum versus bacile Calmette­Guerin adjuvant

immunotherapy of stage II malignant melanoma. J. Clin. Oncol., v. 9, p. 1151­1156, 1991.

MACEWEN, E. G.; PATNAIK, A. K.; HARVEY, H. J. et al. Canine oral melanoma: comparison of surgery versus surgery plus

Corynebacterium parvum. Cancer Invest., v. 4, p. 397­ 402, 1986.

MEYERS, P. A.; SCHWURTZ, C. L.; KLEINERMAN, E. S. et al. Osteosarcoma: a randomized, prospective trial of the addition of

ifosfamide and/or muramy tripeptide to cisplatin, doxorubicin, and high­dose methotrexate. J. Clin. Onc., v. 23, p. 25­29, 2005.

MACEWEN, E. G.; KURZMAN, I. D.; ROSENTHAL, R. C. et al. Therapy for osteosarcoma in dogs with intravenous injection of

liposome­encapsulated muramyl triptide. J. Natl. Cancer Inst., v. 81, p. 935­938, 1989.

MACEWEN, E. G.; KURZMAN, I. D.; VAIL, D. M. et al. Adjuvant therapy for melanoma in dogs: results of randomized clinical

trials using surgery, liposome­encapsulated muramyl triptide, and granulocyte macrophage colony­stimulang factor. Clin. Cancer

Res., v. 5, p. 4249­4258, 1999.

KURZMAN, I. D.; MACEWEN, E. G.; ROSENTHAL, R. C. et al. Adjuvant therapy for osteosarcoma in dogs: results of

randomized clinical trials using combined liposome­encapsulated muramyl triptide and cisplatin. Clin. Cancer Res., v. 1, p. 1595­

1601, 1995.

VAIL, D. M.; MACEWEN, E. G.; KURZMAN, I. D. et al. Liposome­encapsulated muramyl tripeptide phosphatidylethanolamine

adjuvant immunotherapy for splenic hemangiosarcoma in dog: a randomized multi­institutional clinical trial. Clin. Cancer Res., v.

1, p. 1165­ 1170, 1995.

ATKINS, M. B. Immunotherapy and experimental approaches for metastatic melanoma. Hematol. Oncol. Clin. North Am., v. 12, p.

877­902, 1998.

HELFAND, S. C.; SOERGEL, S. A.; MACWILLIANS, P. S. et al. Clinical and immunological effects of human recombinant

interleukin­2 given by repetitive weekly infusion to normal dogs. Cancer Immunol. Immunother., v. 39, p. 84­92, 1994.

FUNK, J.; SCHMITZ, G.; FAILING, K. et al. Natural killer (NK) and lymphokine­actived killer (LAK) cell functions from healthy

dogs and 29 dogs with a variety of spontaneous neoplasm. Cancer Immunol. Immunother., v. 54, p. 87­92, 2005.